TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR EN El DIAGNÓSTICO EN DERMATOLOGÍA

*GARCÍA-ROJO M¹, MORILLO-CASTRO A ²

RESUMEN

La aplicación de las técnicas de biología molecular a las enfermedades de la piel ha permitido conocer los mecanismos íntimos de muchas entidades, facilitando su diagnóstico e incluso su tratamiento. Estas técnicas permiten extraer y analizar el ADN o ARN de sangre periférica o de biopsias de piel, tanto en fresco o en congelación como en los tejidos incluidos en parafina. Las técnicas de hibridación tras la extracción de ácidos nucleicos han evolucionado desde las más sencillas como Southern blot o Dot blot hasta otras más sofisticadas como la hibridación genómica comparada. Sin duda, uno de los campos con más futuro es la aplicación de técnicas de hibridación a las secciones histológicas (hibridación in situ), incluyendo su variación fluorescente para el análisis de cromosomas (FISH, hibridación in situ con fluorescencia). Hoy en día; a mayoría de las técnicas de análisis de ADN se basan en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que puede ser aplicada a un gran número de procesos nosológicos, y destacar sobre las anteriores por su sensibilidad, aunque a costa de una mayor complejidad tecnológica para impedir falsos positivos. De todas las variantes de PCR, la más destacable es la PCR-transcripción inversa (RTPCR), que permite el estudio del ARNm en las células y por tanto es una herramienta imprescindible para conocer la patogenia en tumores, enfermedades infecciosas (como la detección de micobacterias en biopsias de piel de sarcoidosis), entre otras aplicaciones.

Los métodos utilizados para la detección de mutaciones en el genoma se clasifican según su capacidad para ser utilizados como métodos de cribado como el polimorfismo estructural de cadena simple (SSCP) o la electroforesis en gel desnaturalizante (DDGE), frente a aquellos que detectan mutaciones conocidas, como la amplificación especifica de alelos. Basándose en la estructura especial de algunas regiones del genoma humano, se aplican también técnicas basadas en los llamados microsatélites o telomerasas.

En los próximos años, las técnicas moleculares más eficaces seleccionadas por la experiencia se verán facilitadas por la automatización de cada uno de sus pasos, permitiendo incluso un diagnóstico inmediato en la detección de ciertas mutaciones. Sin embargo, la interpretación de estos datos moleculares es más complicada y debe ser valorada justo con la realidad clinicopatológica de cada paciente.

Palabras clave: Biología molecular, técnicas de diagnóstico

 
SUMMARY

The application of the molecular biology to the skin diseases permit us to know the intimal mechanism of several entities, facilitating its diagnosis and even its treatment. These technics permit us to obtain and analyse the DNA or RNAfrom peripheral blood or skin biopsy, in fresh or frozen and in paraffin tissue.

The hybridization technics after the extraction of nucleic acids had evolved from since the single one like Southern blot o Dot blot to others more sophisticated like comparative genomic hybridization. Undoubtedly one of the fields with more future is the application of hybridizations technics to the histologics sections (hybridization in situ) including its fluorescent variation for the chromosome analysis (Fish, hybridization in situ with fluorescence).

At present most of the technics from DNA analysis are bred on the chain reaction of the polymerase (PCR) which can be applicated to great number of nosologic processes and has the advantage upon the precedents because its sensitivity, although it is more complicated to avoid false positives. From all the variants of PCR the most outstanding is the PCR reversal transcription (RTPCR) which permit to study the RNAm in the cells and for this is a invaluable too) in order to know the pathogenic in tumors, infectious diseases (like byopsal of sarcoidosis) between other applications.

The methods used for the detection of mutations in the genome are , classified according their capacity to be used like cribble method, like the structural polymorphism of single chain (SSCP) or the electrophoreticin denaturalizant gel (DDGE) facing others which find known mutations like the specific amplification of alleles.

Based on the special structure of some regions from the human genome, some technics based on the calls microsatelite or telomerase are also applied.

In the next years the most efficient molecular technics selected by the experience shall be facilited for the automatization of each one of their steps, permitting even a immediately diagnosis in the detection of some mutations.

However the interpretation of these available molecular dates still is complicate and should be considered with the clinic-pathologic presentation in each patient.

Key words: Molecular biology, technics of diagnostic.

 
INTRODUCCIÓN

En los últimos años hemos vivido una transición, aún en marcha, en la aplicación de las técnicasde biología molecular desde los laboratorios de investigación científica hacia los laboratorios de patología o de análisis clínicos de los centros hospitalarios. El resultado ha sido poder disponer de numerosas herramientas que han aumentado el arsenal diagnóstico en las enfermedades de la piel. La gran fuerza de estas técnicas reside en su sensibilidad y especificidad para detectar anomalías a nivel del ADN o ARN, en vez de estudiar sus productos proteicos o expresión clínica o morfológica, con frecuencia variables. De esta forma, podemos llegar a un diagnóstico en ausencia de cambios morfológicos discernibles o cambios en la expresión proteica. Además, con frecuencia es necesaria muy poca cantidad de tejido para obtener resultados.

Las técnicas de biología molecular aún son algo complicadas, su costo es elevado y su eficacia en algunos casos aún está pendiente de ser evaluada. Mientras tanto, las técnicas inmunohistoquímicas son más baratas, menos complicadas y la información morfológica se mantiene (por ello, los datos obtenidos son más familiares para los patólogos) y son de un valor inestimable para el estudio de clonas aisladas de células malignas en el contexto morfológico adecuado.

Hoy en día aceptamos que la mayoría de las enfermedades, ya sean congénitas o adquiridas, tienen una base genética^1. Por lo tanto, las técnicas basadas en ADN/ARN son de utilidad en casi todas las áreas de diagnóstico dermatológico, incluyendo procesos neoplásicos, enfermedades infecciosas, condiciones hereditarias y procesos inflamatorios o autoinmunes.

La incidencia del cáncer de piel está aumentando de forma notoria en las últimas décadas, se estima que en Estados Unidos aparecen más de un millón de nuevos casos de cáncer de piel distinto al melanoma cada año^2. La radiación UV se ha asociado sobre todo a este tipo de cáncer distinto al melanoma, y el mecanismo de acción está relacionado con la pérdida de la capacidad de las células epidérmicas para controlar la proliferación celular^3. Las células tienen mecanismos que contrarrestan este daño antes de que se desarrolle el cáncer e incluyen reparación de ADN, apoptosis y vigilancia inmunológica. La radiación UV puede dañar a las células de la piel mediante la formación de dímeros en el ADN entre residuos de pirimidina adyacentes y puede originar mutaciones que se van acumulando con el tiempo. La célula puede responder a este daño reparando el ADN para evitar mutaciones dañinas o, si el cambio es demasiado grande, induciendo la apoptosis para eliminar la célula potencialmente cancerosa⁴Además, la radiación UV parece disminuir las funciones del sistema inmunológico en la piel, creando un ambiente favorable para el desarrollo y crecimiento de tumores⁵. De hecho, los pacientes inmunodeprimidos tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer de piel no melánico, como sucede en los pacientes sometidos a trasplante renal, que desarrollan un número elevado de carcinomas epidermoides, epiteliomas basocelulares, tumores cutáneos asociados a virus y queratoacantomas, principalmente en piel expuesta a la radiación solar⁶.

La carcinogénesis por radiación UV se relaciona con la inactivación de genes supresores (p53 y patched) o la sobreexpresión de oncógenos estimuladores del crecimiento (ras). Tabla 1.³

A diferencia del carcinoma epidermoide, el epitelioma basocelular parece que surge sin un estadio precanceroso. La genética del melanoma es peor conocida, pero también se asocia a mutaciones por rayos UV⁷.

Puesto que la mayoría de los tumores malignos aparecen como consecuencia de eventos genéticos adquiridos y son clonales, son muy adecuados para los estudios de biología molecular ^8. Aunque históricamente los estudios de diagnóstico molecular han sido más utilizados en neoplasias hematológicas, su aplicación en tumores sólidos, concretamente en neoplasias cutáneas está evolucionando rápidamente en los últimos años. De hecho, el descubrimiento y clonación de genes permite detectar nuevos antígenos, que pueden ser dianas para el tratamiento de tumores malignos, como el gen Meian-A/MART-1 en la inmunoterapia del melanoma⁹.

 
BIOLOGÍA MOLECULAR EN El DIAGNÓSTICO EN DERMATOLOGÍA

En las enfermedades infecciosas, las pruebas de biología molecular se han utilizado en aspectos diagnósticos, en estudios epidemiológicos y en la identificación de microorganismos previamente desconocidos¹.

Las enfermedades hereditarias de la piel se caracterizan por mutaciones genéticas. El diagnóstico molecular está hoy día disponible para múltiples enfermedades, en muchas de las cuales anteriormente apenas se disponía de técnicas diagnósticas. Estas técnicas podemos emplearlas no sólo en el diagnóstico directo de la enfermedad, sino también y predominantemente, en la detección de portadores y en el diagnóstico prenatal. El diagnóstico prenatal se realiza fundamentalmente mediante biopsias de vellosidades coriales, que pueden ser obtenidas en forma segura en el primer trimestre del embarazo, aunque también es posible el diagnóstico preimplantación en casos de fecundación in vitro¹⁰.

El diagnóstico molecular de las enfermedades hereditarias ofrece dos ventajas claras. en primer lugar, es notablemente sensible y con frecuencia es suficiente disponer de una sola célula nucleada, en segundo lugar, todas las células del organismo contienen el mismo ADN, lo que conlleva un riesgo elevado de tumores malignos³. En otras enfermedades hereditarias existe una producción proteica defectuosa, frecuentemente en la zona de la membrana basal, como sucede en la epidermólisis ampollosa distrófica y juntural, que se manifiestan clínicamente como fragilidad cutánea y formación de ampollas subepidérmicas originadas por un trauma mínimo¹¹.

En las enfermedades con base inmunológica, la identificación de las principales células y moléculas que intervienen en la iniciación y en el mantenimiento de procesos alérgicos o autoinmunes, probablemente constituirá la base para el tratamiento de este grupo de enfermedades.

En la enfermedad injerto contra huésped, el estudio del quimerismo de los leucocitos permite valorar más detalladamente las causas de neutropenia en enfermos trasplantados, permitiendo un diagnóstico y tratamiento tempranos de la enfermedad injerto contra huésped¹².

El análisis del cariotipo (análisis cromosómico) ha sido una herramienta útil en el estudio de tumores y enfermedades congénitas, tanto para definir diferentes entidades como para proporcionar pistas sobre los mecanismos involucrados en su patogenia. Sin embargo, además de ser una técnica laboriosa, conlleva algunos problemas adicionales^13.

• La necesidad de disponer tejido en fresco.
• Puede ser necesario el cultivo in vitro del tejido.
• Las células en división pueden no ser representativas de la lesión o tumor.
• Los cromosomas obtenidos pueden ser de mala calidad.

Por ello, han surgido nuevas técnicas que detectan anomalías cromosómicas numéricas y estructurales de una manera más rápida y eficiente. La citogenética de interfase es el análisis de cromosomas en células sin división y es diferente del análisis cromosómico convencional, en que se estudian las mitosis detenidas en metafase.

 

OBTENCIÓN DEL ADN/ARN

La práctica totalidad de las técnicas de biología molecular aplicadas a los tejidos cutáneos se basan en el estudio del ADN o en ocasiones del ARN. Por ello el primer paso para llevar a cabo la mayor parte e estas técnicas implica la obtención de ácidos nucleicos, especialmente ADN, a partir de las muestras de las que disponemos¹⁴ Estas técnicas son sencillas pero es importante mantener precauciones para evitar tanto la degradación del material genético por nucleasas (problema especialmente importante en el caso de la extracción de ARN dado que las ARNasas son muy ubicuas)¹⁵. como la contaminación de las muestras por ADN ajeno (problema especialmente importante en el caso de la extracción de ADN destinado a la posterior realización de técnicas de PCR ya que la gran sensibilidad de esta técnica para amplificación génica hacen que cualquier contaminación pueda provocar falsos positivos).

En la actualidad existen kits comerciales para obtención de ADN tanto desde sangre como de tejidos o de células, e incluso se puede llevar a cabo esta extracción de forma automatizada¹⁶. Es importante destacar que es posible la extracción de ADN de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina e incluso de material citológico fijado, en estos casos el material genético probablemente no se encuentre perfectamente conservado aunque aún es útil para la realización de ciertas técnicas como la PCR.

De la sangre o de material citológico obtenido de PAAF (punción aspiración con aguja fina), cultivos o exudados corporales

Se obtiene ADN de las células nucleadas. En el caso de la sangre es suficiente con 10 a 30 mL recogidos sobre EDTA (anticoagulante) para obtener varios cientos de microgramos de ADN en forma de fragmentos de una longitud de hasta 20 kilobases (kb); la cantidad de ADN varia dependiendo de la cantidad de células nucleadas que contenga la muestra. En la extracción se separan las células nucleadas (leucocitos en el caso de la sangre) mediante centrifugación y se usan utilizando una solución que contiene el detergente SDS (dodecilsulfato de sodio) y proteinasa K que libera el ADN al medio y digiere las proteínas. Posteriormente el ADN presente en el sobrenadante se obtiene por precipitación con alcohol etílico absoluto y acetato ¹⁷.

De tejidos frescos o conservados en congelación

En primer lugar hay que homogeneizar el tejido (cortándolo en pequeños fragmentos) para facilitar la posterior lisis de las células que lo componen. Después de homogeneizado se incuba en SDS Y proteinasa K y posteriormente se llevan a cabo una serie de extracciones con fenol y cloroformo que tienen como objeto separar las proteínas del ADN.

De tejidos incluidos en parafina

El ADN de estas muestras es estable durante años (el ADN es una molécula muy estable y su estructura molecular es muy difícil de alterar a diferencia del ARN). Se obtiene secciones de tejido que desparafinan y se incuban durante unas horas con SDS y proteinasa K, a partir de aquí se procede igual que con los tejidos congelados. Es necesario tener en cuenta que a veces el ADN genómico tras la inclusión en parafina se encuentra fragmentado, hecho que es necesario tener en cuenta para futuros análisis. Por ejemplo es desaconsejable intentar amplificar mediante PCR fragmentos de ADN de gran longitud partiendo de ADN obtenido de este material. También es importante saber que algunos fijadores (como el Bouin o los mercuriales) degradan el ADN de forma más intensa que el formaldehído, lo que dificulta los estudios sobre material que se ha fijado con ellos (por ejemplo las biopsias de médula ósea)^18,19.

TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS 
HIBRIDACIÓN TRAS LA EXTRACCIÓN DEL ADN

Southern blot

La denominación de esta técnica proviene del nombre del autor que la introdujo en 1975²⁰. La técnica consiste en tratar el ADN con enzimas de restricción (enzimas que cortan el ADN por secuencias específicas), tras lo cual se separan los fragmentos mediante electroforesis en un gel de agarosa quedando separados según el tamaño de los fragmentos de ADN. Después de la electroforesis el gel se trata para desnaturalizar el ADN que se transfiere a un filtro de nitrocelulosa o nylon mediante un sistema de vacío, sobre el que se fija con luz ultravioleta ("crosslinker” o calor, una vez tratado el ADN tiene cargas negativas) y por último se expone la membrana a sondas complementarias (hibridación) de la cadena que deseamos buscar marcadas radioactivamente o con digoxigenina-biotina, las sondas quedarán fijadas al fragmento de ADN del que son complementarias lo que nos confirma que el ADN de la banda correspondiente es efectivamente el que buscamos (1²¹).

Aplicación en Dermatología

Southern blot sigue siendo una de las técnicas más fiable en biología molecular, y es empleada para el estudio de reordenamiento, amplificación, deleciones y mutaciones puntuales de genes²².

Esta técnica se ha venido utilizando para la detección de reordenamientos del gen de las inmunoglobulinas en la detección de monoclonalidad del tejido linfoide: si hibridando con una sonda complementaria a parte del gen estructural de las inmunoglobulinas (por ejemplo la sonda JH) se detecta que todos o la mayoría de los fragmentos obtenidos en este área del genoma al fragmentar el ADN son del mismo tamaño, hay que asumir que toda o la mayoría de la población linfoide está reordenando sus genes de inmunoglobulinas de la misma manera lo que implica monoclonalidad. Aunque algo más complicado que por PCR, también puede aplicarse el análisis Southern blot en tejidos incluidos en parafina. Actualmente la PCR ha sustituido al Southern blot en detección de reordenamientos¹⁹.

La presencia de translocaciones (como t(2:5) en el linfoma anaplásico) puede ser detectada incluso en tejidos incluido en parafina²³.

Aunque ha sido sustituida por otras técnicas, hasta hace pocos años, era el "gold standa” para la detección de HPV y subtipos²²

La principal ventaja de Southern blot son sus altas especificidad y reproducibilidad y permitir la valoración del estado físico del ADN, y así poder valorar si el ADN viral está integrado en el genoma del huésped o permanece como episoma en el huésped, Es un método excelente para detectar pérdidas homocigóticas. Las desventajas de Southern blot son que es una técnica de larga duración, que requiere un personal entrenado, y aún así son frecuentes los artefactos y la variabilidad entre laboratorios²⁴. Además, precisade una cantidad relativamente alta de ADN, sólo permite estudiar una pequeña región del genoma con cada sonda y la mayoría de las sondas son poco informativas (heterocigosidad baja)²⁵.

Northern blo

También es posible aplicar la técnica de Southern blot a ARN con algunas modificaciones, denominándose Northern blot, el cual puede ser aplicado a las biopsias de piel, a las que se aplican técnicas de extracción de ARN²⁶. A diferencia del Southern blot, no es necesaria la digestión con enzimas de restricción y, aunque el ARN es una cadena única, su estructura secundaria compleja hace necesario el uso de técnicas de desnaturalización, generalmente con formaldehído y formamida. Así, una vez extraído el ARN se aplica electroforesis en geJes de 1% de agarosa-formaldehído²⁷. El ARN puede ser teñido con colorantes como el naranja de acridina. Posteriormente es transferido a membranas de nylon especiales (Hybond­N⁺). Estos "blots" son posteriormente hibridizados con sondas de ADN complementario marcado (por ejemplo, con ³²P para involucrina). La cantidad del marcador obtenido puede ser medida mediante un densitómetro de láser aplicado al autorradiograma obtenid²⁸.

Aplicación en dermatología

Aunque el northern blot se utiliza para analizar el ARN en el tejido completo, la hibridación in situ es una técnica que permite determinar la expresión de un gen (ARNm) o la presencia del gen en sí (ADN), en células individuales tanto en secciones tisulares como en preparaciones citoiógicas₂₉.

Se ha utilizado para analizar la expresión de ARNm específico de determinadas proteínas, como la estromelisina 3, una proteína que podría jugar un papel significativo en la destrucción de la zona de la membrana basal y en la matriz extracelular en la invasión del epitelioma baso­celular³⁰.

En la acrodermatitis enteropática se ha utilizado Northern blot para caracterizar los gen involucrados, similares a los de la subunidad 11 de citocromo oxidasa y LINE 1 retrotransponsons humano³¹

Western blot o immunoblot

Asimismo es posible aplicar la electroforesis en gel de poliacrilamida a homogeneizados de proteínas, transferirlas a una membrana y revelarlas con anticuerpos específicos similares a los utilizados en inmunohistoquímica^32.

La gran ventaja de este método es que permite reconocer el peso molecular de la proteína en estudio y tiene mayor fiabilidad que otros métodos, aunque no aporta información sobre su localización en el contexto celular y tisular de la lesión²¹.

Aplicación en Dermatología

En los estudios de carcinogénesis con frecuencia se valora la expresión de algunos genes, como la proteína del retinoblastoma, para conocer el efecto inhibidor de determinadas sustancias. De esta forma, se ha comprobado que algunas sustancias presentes en el té verde, muy consumido en el lejano Oriente, inhiben el crecimiento de células tumorales, reduciendo el nivel de proteína del retinoblastoma, por lo que estas sustancias podrían servir para la quimioprevención del cáncer al impedir la progresión de las lesiones leucoplásicas de la boca³³

En los estudios de dermatitis de contacto por irritantes, se emplea Western blot para comprobar una disminución de los niveles de la proteinquinasa C³⁴.

También se emplea en la identificación de anticuerpos circulantes frente a determinados microorganismos, como en la leishmaniasis cutánea.

Hibridación genómica comparativa

Se utiliza para evaluar el número total de aberraciones del genoma de la muestra a analizar basándose en la capacidad del ADN para la hibridación con secuencias homólogas. Se trata de extraer ADN de células normales y de células tumorales tras lo cual se híbrida con células diana normales. Dado que las células diana y el ADN control (extraído de células normales) presentan el mismo ADN (homología 100%) las diferencias al comparar la hibridación control y la de la muestra tumoral se deberán a anomalías presentes en el tumor La valoración cuantitativa de esta diferencia ha de hacerse utilizando un sistema de análisis digital de imágenes²¹.

Sus ventajas consisten en que permite identificar todo el genoma de las células malignas al mismo tiempo, distin­gue con facilidad regiones de pérdida o de ganancia alélica y necesita cantidades muy pequeñas de ADN. Las desventajas se centran sobre todo en la baja resolución y en no aportar información sobre el origen materno o paterno del alelo²⁵

Aplicación en dermatología

Poco utilizado en general, se ha aplicado al carcinoma epidermoide de cavidad oral, que presenta un patrón de desequilibrio genético distinto al observado en otros carcinomas. De hecho, la diferenciación hacia carcinoma epidermoide en cavidad oral se asocia con ganancias en 3q, 5p, 11q 13 y 19, pero también con pérdidas en 3p, 5q21, 8p y 9p. Sin embargo, este patrón no se confirma en el carcinoma epidermoide fuera de la cavidad oral³⁶.

Las deleciones y las inserciones de material genético en tumores sólidos pueden ser documentadas mediante hibridación genómica comparada o FISH. La primera tiene la ventaja de no precisar de sondas específicas³⁷.

Slot-blot y Dot blot

Consiste en transferir directamente el ADN a la membrana sin haber realizado previamente rotura del ADN ni electroforesis e incubarlo con sondas de ADN complementarias a las secuencias de ADN que buscamos (que contengan las mutaciones que buscamos). En este método cada muestra se coloca en un punto determinado (“dot”)y posteriormente se desnaturaliza para que la hibridación pueda tener luga³⁸.

Existe una variante de esta técnica en la que las sondas de ADN complementarias a la que buscamos ya se encuentran inmovilizadas en el filtro de nylon al que se hace la transferencia y lo que marcamos es el ADN muestra (dot-blot inverso).

La existencia de reactivos comerciales de rápida realización, en los que el revelado puede realizarse con sustancias quimioluminiscentes, ha facilitado la aparición de kits comerciales basados en esta técnica³⁹.

Aplicación en dermatología

Se utilizan poco. Se han usado para detección de mutaciones de la familia ras en tumores. Se utiliza, en general, cuando no es necesario fragmentar por su tamaño el ácido nucleico. Es una técnica adecuada para el estudio de múltiples muestras o la valoración semicuantitativa utilizando diluciones seriadas del ADN de prueba³⁸.

Los kits comerciales basados en hibridación dot blot para el virus del papiloma humano (ViraPap/Vira Type, Laboratorios Digene, EE.UU.) utilizan sondas radioactivas específicas para siete genotipos HPV (HPV 6, 11 16, 18, 31,33 y 35). Su sensibilidad es idéntica a Southern-blot⁴⁰, aunque menor que los métodos de amplificación que veremos posteriormente⁴¹. Estos kits están siendo susti­tuidos por el método de captura hibrídica.

Captura hibrídica. Hibridación en fase de solución

El método captura hibrídica (Laboratorios Digene, EE.UU.) es actualmente el más popular para la detección de infecciones por el HPV Se basa en las técnicas más antiguas de metodología de trabajo con ácidos nucleicos: la hibridación en fase de solución, en la que tanto el ADN diana del HPV como la sonda interaccionan libremente en una solución acuos⁴². Puede ser aplicada a células descamadas o en muestras de tejidos. Se utiliza dos mezclas de sondas de ARN, una para los genotipos HPV de bajo riesgo: 6,11,42, 43 y 44, y otra para los genotipos HPV de riesgo intermedio/alto: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68. Las muestras positivas se detectan uniendo los complejos de la hibridación en tubos revestidos con un anticuerpo monoclonal ligado a fosfatasa alcalina contra híbridos ARN:ADN. Al añadir una sustancia quimioiuminiscente, la emisión de luz puede ser medida en unidades relativas de luz⁴³. La sensibilidad de la prueba se estima en 1000 copias de ADN de HPV-16, algo menos que PCR, pero con una mayor especificidad²².

HIBRIDACIÓN DIRECTA SOBRE CORTES HISTOLÓGICOS O CÉLULAS
Hibridación "in situ"

La técnica permite la localización de secuencias de ácido nucleico, ADN, ARN virales, ARN celular o ADN cromosómico, en el lugar del tejido en el que se encuentra.

La hibridación es de gran valor en estudios genéticos, permitiendo el análisis de la regulación temporal y espacial de la expresión de genes. También se utiliza en el diagnóstico en medicina, para identificar secuencias virales en tejidos y proporcionar información sobre los mecanismos patogénicos de las infecciones viraLes. Asimismo, la hibri­dación in situ puede ser aplicada en el mapeo físico del genoma y en la identificación e interpretación de reordenamientos genéticos⁴⁴.

La característica que la distingue de otros métodos basados en hibridación -como la hibridación de Filtro y las técnicas de ciclos térmicos (reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ligasa de ADN, etc.)- es que el ADN de la muestra no es extraído sino que es detectado directamente en la célula intacta.

Parte de un corte de tejido o de material citológico extendido sobre un porta (preferiblemente tratado con 3­aminopropiltrietoxisilano). En primer lugar la sección o el frotis citológico se trata enzimáticamente con proteinasa K o pronasa o se calienta en microondas, con el fin de romper las envolturas celulares y permitir el acceso de la sonda al núcleo durante la hibridación (lo que no altera la morfología celular), posteriormente, se procede a la desnaturalización del ADN cromosómico por calor (95°C) y posteriormente se añade una solución que contiene la sonda con el ADN o ARN marcado con componentes radioactivos como P³² I¹²⁵ S³⁵, H³ o componentes no radioactivos como peroxidasa, biotina o digoxigenina complementarios a la secuencia genómica que buscamos ^45-48 El marcador empleado (p. El: digoxigenina) es marcado (fosfatasa alcalina) y posteriormente es revelado (fuchsina/haftol-AS-bifosfato^49,50.

Los mejores resultados se obtienen en tejidos fijados en formol o en paraformaldehído, y con menor éxito, la hibridación in situ también puede ser aplicada a tejidos congelados o tras fijación en alcohol u otros fijadores coagulantes²².

La sonda para la detección de un fragmento de ARN mediante hibridación in situ puede ser generada mediante RT-PCR utilizando determinado cebadores⁵⁰.

La hibridación es más sensible, en general, que las técnicas de inmunohistoquímica, pues éstas pueden dar resultados negativos según el grado de síntesis del componente buscado, la degradación intracelular, el transporte intracelular o por procesos postraducción de péptidos que modifiquen la estructura proteica buscada. Sin embargo, la hibridación in situ es menos sensible que las técnicas de hibridación en filtro (Southern blot) y PCR (Tabla 2). Un ejemplo lo tenemos en las lesiones por el virus del papiloma humano (HPV), en el que la infección por HPV oculta, sin evidencia de enfermedad microscópica o microscópica, el número de genomas de HPV en las células escamosas puede ser de uno o de muy pocas copias y, por lo tanto, sólo será detectado mediante Southern blot o PCR^44.

La sensibilidad de la hibridación in situ puede ser aumentada utilizando moléculas biotiniladas de tiramida, que amplifican la señal obtenida. Las tiramidas son moléculas que, una vez activadas por una molécula de peroxidasa unida a la sonda de detección, se unen de forma covalente a la proteína más cercana disponible⁵¹. Otro método para detectar ADN de HPV cuando está presente en muy pocas copias en tejidos, es la hibridación in situ fluorescente estudiando las señales de hibridación mediante microscopia confocal láser de rastreo, que permite detectar una o dos copias de ADN de HPV por célula⁵².

La hibridación in situ se utiliza para localizar en el tejido la expresión oncogénica de un componente particular (por ejemplo, detectar el gen Wtl en el tumor de Wilms), para correlacionar el grado de expresión de un oncogén con el grado de atipia citológica, y para correlacionar la detección de ARNm de un oncogén con la proteína de dicho oncogén usando simultáneamente inmunohistoquímica). Además, la hibridación in situ puede realizares no sólo junto con inmunohistoquímica, sino combinada por PCR (PCR in situ) o en microscopia electrónica, utilizando oro coloidal¹³.

Aplicación en Dermatología

a. Infecciones virales

Se ha aplicado a la detección de ADN de virus como virus del papiloma humano (HPV) especialmente útil para diferenciar subtipos), EBV o CMV permitiendo detectar infecciones productivas y latentes.

Virus del papiloma humano (Tabla 3).

La hibridación in situ ha sido una herramienta esencial para comprender el papel del HPV en las lesiones intraepiteliales escamosas (SILs) del tracto genital inferior⁵³. Los siguientes aspectos han sido determinados gracias a la hibridación in situ:

- El ADN del HPV es más abundante en las células más superficiales que muestran halos perinucleares y atipia nuclear.

- El número de copias del ADN del HPV es mucho mayor en las SILs de balo grado que en las SILs de alto grado o el cáncer invasor

- La diversidad de tipos HPV es mucho mayor en las SILs de cérvix que en las SILs de vulva o de pene. HPVs 6 y 11 son relativamente raros en SLIs de bajo grado de cérvix, y por el contrario son detectados en más del 95% de las lesiones equivalentes de la vulva. El tipo HPVs 6y 11, el más frecuente en cáncer de tracto genital y el más frecuente en lesiones de alto grado, es también el más frecuente en SILs de cérvix, pero rara vez aparece en lesiones de bajo grado vulvares o peneanas⁴⁴.

Una aplicación práctica es que, a diferencia de las lesiones cervicales (en las que se necesitan más de 14 sondas distintas), podríamos utilizar en sólo sondas para HPV 6, 11 y 16 para el estudio de lesiones en vulva y pene.

Definimos infección oculta por HPV como la presencia del virus en ausencia de evidencia clínica o anatomopatológica de infección. Mediante el empleo de Southern blot, el porcentaje de infección oculta en el tracto genital inferior es de un 10%. Cuando se utiliza PCR, se encuentran tasas de hasta un 30%. La hibridación in situ no es una técnica útil para la detección de infección oculta ni para el estudio en el cáncer invasor, pero es tan eficaz como el Southern blot o la PCR para la detección de ADN de HPV en lesiones de balo grado, en las que nos permite tipificar el HPV⁴⁴.

En el caso de lesiones vulvares o peneanas difíciles de interpretar en el examen histológico, la tasa de detección de infección por HPV mediante hibridación in situ es de un 8% , frente al 1-2% de lesiones difíciles de interpretar en cérvix⁴⁴. Esta diferencia probablemente reflela el hecho de cambios citológicos más evidentes en las SILs de cérvix que en las lesiones de vulva o de pene.

Se piensa que el HPV 5 juega un papel importante en la transformación maligna en la epidermodisplasia verruciforme⁵⁴.

La presencia de HPV permite a su vez realizar el diagnóstico diferencial de verrugas virales con otras lesiones cutáneas como la queratosis seborreica⁵⁴

- Citomegalovirus (CMV)

Además de órganos profundos (cerebro, riñón, pulmón, etc.) este virus frecuentemente afecta a mucosa (conjuntiva o tracto aerodigestivo). Los cambios citológicos del citomegalovirus son característicos, describiéndose inclusiones eosináfilas intranucleares rodeadas de una zona clara de cromatina periférica en grumos e inclusiones citoplasmáticas basófilas⁵⁵. La hibridación in situ de estas células muestra una señal de hibridación constantemente intensa, debido a la presencia de cientos o miles de copias de los genomas virales en el núcleo. Sin embargo, con esta técnica se observa muchas más células infectadas por CMV que las apreciadas en el examen morfológico inicial^56-58.

- Virus de Epstein-Barr (VEB)

La infección por VEB, un virus ADN miembro de la familia Herperviridae, generalmente causa una seroconversión asintomática o mononucleosis infecciosa. El VEB también está asociado a linfoma de Burkitt, carcinoma nasofaríngeo y a procesos linfoproliferativos en inmunodeficiencias congénitas y adquirida⁵⁵.

La hibridación in situ es especialmente útil para demostrar la presencia de VEB en infiltrados linfoides. La infección por el virus de Epstein-Barr puede ser determinada mediante hibridación in situ para detectar pequeños fragmentos de ARN del virus (EBER 1 y 2)^59,60,61.

Una variación genotípica en el VEB que puede tener significación patogenética es la deleción de 30pb en el gen LMP 1 del VEB, cuya proteína favorece la expresión de diferentes genes celulares e inhibe la apoptosis al inducir a bcl-2⁶³.

En la amiloidosis cutánea primaria (liquen amiloideo y amiloidosis maculosa) se ha detectado la presencia del virus de Epstein-Barr (EBERs) en un 40,7% de los casos, aunque el papel etiológico del virus en la amiloidosis cutánea primaria está aún por dilucidar⁶³.

- Virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1)

El diagnóstico de infección por VIH generalmente se realiza mediante pruebas serológicas, por Western blot o técnicas de diagnóstico molecular.

Una vez que el virus penetra en una célula, el genoma ARN sirve de molde para la síntesis de una copia de ADN complementario (ADNc) mediante la transcriptasa inversa ^64,65. El ARN viral es destruido y el ADN se integra en el genoma humano, donde puede permanecer latente durante años. El virus latente puede no ser detectado mediante hibridación in situ pero puede ser detectado mediante PCR. Sin embargo, cuando el virus "es activado" puede sintetizar muchas copias (más de 50) de su ARN, que entonces pueden ser detectadas mediante hibridación in situ, aunque con frecuencia la infección activa del VIH no puede ser detectada mediante hibridación in situ porque el virus con frecuencia no realiza muchas copias de su ARN^64-66. Combinando PCR e hibridación in situ con RT-PCR in situ podemos detectar la infección por VIH-1 in situ y distinguir entre infección latente e infección activa⁴⁴.

- Virus del herpes simple y zoster

Junto con los estudios inmunohistoquímicos para las glicoproteínas gB, gC y gD del virus del herpes simple, la hibridación in situ permite localizar el virus del herpes simple 1 y 2 y el virus varicela-zoster incluso en las lesiones cutáneas de curso prolongado en las que sólo se identifica un patrón inflamatorio liquenoide y no se observa lesiones cito líticas ^67-69.

- Otras infecciones virales

La hibridación in situ es útil para documentar otras infecciones virales donde las características citomorfológicas en el telido no son muy llamativas, como en el adenovirus⁵⁸. La técnica es especialmente útil cuando se asocian múltiples infecciones virales simultáneamente⁶⁹.

b. Patología tumoral

La hibridación in situ es un método muy útil para detectar el ARN de hormonas peptídicas, cadenas ligeras o cadenas pesadas de inmunoglobulinas. También permite estudiar la sobreexpresión oncogenes como de N-myco de bcl-2 en linfomas foliculares.

En el epitelioma basocelular de piel, mediante hibridación in situ se ha detectado expresión de estromelisina 3, una metaloproteasa capaz de degradar un amplio número de proteínas como colágenos IV IX y XI, fibronectina, elastina proteoglicanos y en células estromales inmediatamente adyacentes al tumor epitelial. Sin embargo, no se ha observado correlación entre la expresión de estromelisina 3 y el subtipo histológico de epitelioma basocelular. En el melanoma no se identifica estromelisina 3³⁰ . En el carcinoma epidermoide infiltrante se ha detectado estromelisinas (STI y ST2)⁷⁰.

La expresión del gen del factor de crecimiento de telido conluntivo (CTGF) se estudio mediante hibridación in situ, generalmente en tumores de fi brohistiocitarios y vasculares. Se ha observado que el ARNm de CTGF se expresa en los fibroblastos de dermatofibromas y es negativo en el dermatofibrosarcoma protuberans y en el fibrohistiocitoma maligno. Además, las células endoteliaies en el granuloma piogénico, el angiolipoma y el angioleiomioma expresan ARNm CTGF pero no lo hace el lago venoso ni el angiosarcomal ⁷¹.

El receptor del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGFR-3) es un marcador específico de células endoteliales linfáticas. Mediante hibridación in situ este marcador se detecta en los linfáticos de piel normal, en el endotelio de la linfangiomatosis cutánea y apenas se expresa en hemangiomas cutáneo⁷².

c. Procesos inflamatorios crónicos

La hibridación in situ se ha empleado en la investigación de mecanismos inmunológicos, como el estudio de quemoquinas, por ejemplo, IP-9 (proteína inducible por el interferón gamma-9), cuyo ARNm que se expresa en queratinocitos basales en una serie de trastornos cutáneos como dermatitis de contacto alérgica, liquen plano y micosis fungoides^73.

El estudio inmunohistoquímico y de ARNm en biopsias de piel de las moléculas de adhesión indica que en los estadios avanzados de insuficiencia venosa crónica, caracterizados por hiperpigmentación y esclerosis en dermis y tejido celular subcutáneo, que preceden a la ulceración cutánea, la expresión de ICAM-1 (molécula de adhesión intercelular-1) y VCAM-1 (molécula de adhesión celular vascular1) permanece elevada, lo que probablemente haga perdurar el daño tisular a través de la llegada de leucocitos activados que Finalmente conduce a la ulceración de la piel⁷⁴.

FISH

Se utiliza sondas especificas para determinados cromosomas o secuencias de ellos. Se desnaturaliza el ADN con calor y se incuban las muestras con formamida y tampón o bien son a su vez detectables por un intermediario marcado con fluorescencia. Esto nos permite poner de manifiesto alteraciones cromosómicas (translocaciones, deleciones, monosomías y trisomías). Para utilizar la FISH es necesario que las células se encuentren en metafase o en interfase. Para estudiar pequeñas translocaciones cromosómicas con sondas completas de un determinado cromosoma, la técnica ha de realizarse en metafase con los cromosomas separados para lo cual es necesario disponer de un cultivo celular⁷⁵.

Es una técnica de gran sensibilidad que puede realizarse con relativa rapidez. El FISH centromérico permite contar exactamente el número de centrómeros presentes en una célula, o valorar varios centrómeros a la vez en cada célula usando zonas de varios colores, además requiere una cantidad de ADN muy pequeña. Las desventajas de esta técnica es que es muy laboriosa, no permite estudiar las muestras varias veces , no puede ser automatizada y es difícil la diferenciación morfológica entre células normales y malignas²⁵.

Se emplea tres tipos de sondas^21:

1. Pintado de cromosomas: Es una sonda compuesta por:

a. secuencia específica de un cromosoma, y
b. secuencias compartidas por otros cromosomas. El resultado obtenido es una hibridación uniforme en todo el cromosoma diana.

2. Sondas centroméricas: Se basan en el ADN satélite alfa (a), que son secuencias específicas de cada cromosoma.

3. Sondas de cósmidos: vectores que cionan fragmentos grandes de ADN de eucariotas.

Aplicación en dermatología

Identificación de anomalías cromosómicas en muestras prenatales (numéricas. translocaciones, etc), detección de translocaciones específicas de determinados tipos tumorales o t(9,11) o t(9,22)en leucemias mieloides, altercaciones del cromosoma 12 en los lipomas) o incluso detección de amplificaciones de oncogenes como el neu en los carcinomas de mama o de próstata, o detección de inserción cromosómica de genomas virales.

Se ha detectado la presencia de trisomía 7 en algunos estudios de queratoacantomas, una alteración también descrita en el carcinoma epidermoide de piel⁷⁶.

Al igual que el estudio de p53 mediante PCR, se ha utilizado FISH para valorar los márgenes de resección de neoplasias. Valorando el número de copias de ciertos cromosomas en células epiteliales descamadas mediante cepillado, puede detectarse células tumorales en márgenes aparentemente libres de tumor en el carcinoma epidermoide de cavidad oral⁷⁷

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Es una técnica introducida en 1985, capaz de generar grandes cantidades de copias de un determinado fragmento de ADN a partir de mínimas cantidades del mismo (amplificación) en pocas horas⁷⁸.

TÉCNICAS

La PCR se basa en la replicación del ADN por los enzimas denominadas ADN polimerasas (se utiliza la Taq polimerasa porque es termoestable). Estas enzimas producen copias de ADN complementario a partir de una cadena de ADN de cadena simple (tras desnaturalización del ADN mediante calor) pero sólo pueden empezara copiar añadiendo nucleótidos a una cadena de ácidos nucleicos que debe estar previamente acoplada al ADN de cadena simple (el iniciador o "primer").

La técnica consiste en utilizar dos oligonucleótidos de secuencia conocida que se acoplen específicamente a los márgenes de una determinada secuencia que queremos amplificar, después se añade la Taq polimerasa, nucleótidos y MgC 12 (indispensable para la reacción). La Taq polimerasa actuará copiando la secuencia de ADN contenida entre los iniciadores. El proceso se repite múltiples veces mediante la sucesión de ciclos en los que se varía la temperatura de la muestra, así al aumentar la temperatura de la muestra se produce la desnaturalización del ADN de doble cadena. Luego se vuelve a disminuir la temperatura con lo que se produce la hibridación o emparejamiento (annealing) de los oligonucleótidos (primers) con sus secuencias complementarias específicas;tras la hibridación actúa la Taq polimerasa (extensión) Esta secuencia constituye un ciclo, se suceden posteriormente varios ciclos en los que se separa el ADN de doble cadena recién copiado al aumentar el calor y al enfriarse la muestra vuelven a producirse hibridación y extensión de manera que la secuencia de ADN contenida entre los iniciadores se replica de modo exponencial, lo que permite obtener una gran cantidad de copias de la secuencia elegida partiendo de muy escasa cantidad de ADN inicial. En cada ciclo se dobla la cantidad de ADN del ciclo anterior, según la fórmula 2ⁿ (donde "n" es el número de ciclos)^79,80

En general en una PCR el número de ciclos varía entre 25 y 40 no siendo aconsejable alargar el número de ciclos más allá de 40, puesto que la amplificación sigue un proceso exponencial hasta aproximadamente el vigésimo ciclo para alcanzar después poco a poco una meseta donde no hay más incremento en la producción de ADN^80.

La temperatura de hibridación (annealing), el tiempo de cada etapa, el número de ciclos y las condiciones de la reacción son muy variables y se han de adaptar según la naturaleza del ADN a copiar y de los cebadores, la calidad de la Taq polimerasa, el tipo de aparato termociclador (Figura 2), etc. Por ello es necesario desarrollar un protocolo específico para cada una de las secuencias de ADN que deseemos aplicar (por ejemplo, replicar una secuencia de ADN del virus de HPV 18 requiere unas condiciones diferentes que replicar una cadena de ADN de IgH humana y no basta sólo con cambiar los iniciadores específicos⁸⁰.

Debido a la gran sensibilidad de la técnica uno de los principales problemas es el riesgo de contaminación con ADN extraño y la aparición subsiguiente de amplificaciones no deseadas⁸¹.

Los iniciadores o cebadores o "primers" son secuencias de entre 15 Y 30 nucleótidos que se han de hibridar a cada lado de la secuencia a amplificar. En algunos casos se utiliza «cebadores degenerados», es decir mezclas de cebadores que se diferencian en alguna base; esas mezclas se usan para la detección de secuencias conservadas, por ejemplo, entre distintos genotipos de los mismos virus (HPV)²².

La técnica puede ser aplicada a tejidos fijados en formol e incluidos en parafina, aunque es conveniente que los fragmentos de ADN buscados no superen los 300 pares de bases. Otros fijadores como B5 no son adecuados para los estudios de PCR^22.

 

ANÁLISIS DEL PRODUCTO DE PCR

El método más frecuente y universal de detección de ADN es la electroforesis en un gel teñido con bromuro de etidio (para permitir la visualización del ADN puesto que esta molécula se inserta entre las bases entre las bases del ADN dando lugar a una alta densidad electrónica) y la visualización del ADN cuando el gel se expone a luz ultravioleta que estimula los electrones en los lugares donde hay depósito de bromuro de etidio provocando autofluorescencia. Las bandas gruesas obtenidas tras la electroforesis del producto de PCR corresponden a las secuencias de ADN que han sido copiadas por la Taq polimerasa y su tamaño es conocido porque en cada electroforesis en uno de los pocillos se añade una mezcla con fragmentos de ADN de tamaños conocidos, así, según la altura a la que caiga la banda conoceremos su tamaño.

Aplicando este método podemos saber si se ha amplificado la cadena de ADN específica. Por ejemplo de HPV frente a la que habíamos diseñado los iniciadores, lo que indicara que esta cadena estaba presente en el ADN de la muestra y por lo tanto existe infección viral. Otros ejemplos de amplificaciones de oncogenes son el N-myc en el neuroblastoma y c-erbB-2 en el carcinoma de mama.

En ocasiones lo que nos interesa no es saber sólo si se amplifica o no una secuencia sino el tamaño de la secuencia que se amplifica. Por ejemplo, en el estudio de clonalidad del tejido linfoide se amplifican secuencias de ADN que siempre están presentes en el tejido linfoide (generalmente las que codifican para IgH o TCR). Lo que nos interesa es saber si las secuencias amplificadas por la PCR tienen todas el mismo tamaño (lo que implicaría monoclonalidad del tejido) o son de tamaños variables (lo que implica policlonalidad). Esto ocurre así debido a la propiedad del tejido linfoide de reordenar su ADN durante su proceso de maduración de forma que en cada clon la longitud del fragmento de ADN que codifica para IgH o TCR es de distinto tamaño. Para poder detectar estas diferencias de longitud en estas secuencias concretas se utiliza cebadores complementarios a regiones relativamente estables (secuencias de consenso) dentro de estas secuencias que flanqueen regiones denominadas hipervariables. Existen sistemas comerciales , basados en fluorescencia (fluorescent fragment analysis) que facilitan estos pasos e incluso incluyen sistemas informáticos que analizan el tamaño de los productos de PCR (GeneScan, Appliad Biosystems, EE.UU.)¹⁶.

Aplicación en Dermatología

Es una técnica extraordinariamente útil por su sensibilidad y por requerir muy poco ADN, de forma que puede ser utilizada en tejidos incluidos en parafina ^82,83.

AMPLIFICACIÓN DE ADN

Permite replicar fragmentos de ADN con la única condición de que se conozcan al menos dos secuencias génicas entre las cuales se localice el fragmento. Esto permite que tras la extracción de ADN se pueda amplificar el fragmento que nos interesa estudiar y disponer de una gran cantidad de material sobre el que se puede realizar distintos estudios (como técnicas de hibridación, u otras técnicas de las que hablaremos más adelante), como el estudio de mutaciones cromosómicas (ver más adelante). De hecho en la actualidad la práctica totalidad de estos estudios se realizan sobre productos de PCR.

De esta forma, pueden ser detectadas translocaciones, como t(12-16) en el Liposarcoma mixoide, anomalías de genes supresores (Rb o p53), microorganismos: (como micobacteriosis) y se aplica en el estudio de inestabilidad microsatélite.

El ADN puede ser aislado de secciones en parafina con un extractor de ADN automático⁸⁴.

DETECCIÓN DE INFECCIONES

La simple amplificación de ADN que en condiciones normales no debería encontrarse en tejidos humanos (ADN viral o bacteriano) permite establecer la presencia de infección (Tabla 4).

La identificación directa de bacilos ácido alcohol resistentes en las secciones tisulares, aunque rápida, es de bala sensibilidad, ya que requiere una gran cantidad de microorganismos (104/ML). Además, la tinción directa es inespecífica, ya que no permite diferenciar las distintas especies de micobacterias, lo que resulta de especial importancia en pacientes VIH+⁶². La amplificación mediante PCR seguida de digestión con enzimas de restricción del producto de PCR es un método rápido (en menos de tres días) y sencillo para la detección y diferenciación entre Mycobacterium tuberculosis y M. avium-intracellulare en esputo, líquido cefalorraquídeo o en tejidos incluidos en parafina, sin necesidad de esperar las 3 a 8 semanas que supone en cultivo del microorganismo^62,85 . Algunos de los genes de M. tuberculosis más frecuentemente utilizados son IS6110, una secuencia de inserción repetida entre 1 y 24 veces en las micobacterias del complejo M. tuberculosis, o el gen hsp65, muy conservado entre las distintas especies de micobacterias, que codifica la proteína de choque térmico de 65 kDa⁶².

Utilizando iniciadores específicos de ARN ribosómico del agente de la angiomatosis bacilar (Rochalimaea henselae), una entidad similar a la verruga peruana o enfermedad de Camón⁸⁶, mediante PCR se puede identificar secuencias de ADN específicas de este microorganismo^87,88. En pacientes con SIDA se describe la presencia simultánea de múltiples agentes infecciosos, como Mycobacterium avium-intracelular en combinación con angiomatosis bacilar⁸⁹.

En la enfermedad de Lyme, en Europa, se describe al menos tres agentes causantes: Borrelia burgdorferi sensu stricto, B. garinii y B. afzelii. Los estudios mediante PCR con ARN ribosómico 16S ribosomal confirman que B. afzelii es la bacteria más frecuente, pero no el único agente etiológico de la acrodermatitis crónica atrófica⁹⁰.

La PCR es efectiva en la detección de ácidos nucleicos virales tanto en tejidos frescos como fijados en parafina, y se ha empleado con éxito en infecciones por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)⁹¹, virus de Epstein-Barr⁹², citomegalovirus⁹³, subtipos específicos del virus del papiloma humano⁹⁴ y virus del herpes simple^95.

De esta forma, es posible documentar una infección temprana por citomegalovirus en pacientes inmunocomprometidos⁹⁶, incluyendo los trasplantados de médula ósea y la infección por VIH. Además, las técnicas de PCR son discriminantes en el contexto de resultados "indeterminados" obtenidos en inmunoblots de VIH⁹⁷.

La PCR es el método detección de HPV más sensible. Existen numerosos sistemas de detección de genotipos HPV basados en PCR y se ha diseñado varios protocolos específicos de genoma, principalmente basados en cebadores seleccionados de las regiones del HPV L1 o El (estos dos marcadores de lectura abierta son los más conservados entre los distintos tipos de HPV), ES, E6 y E7. Una vez detectado el HPV para confirmar la especificidad e identificar los genotipos de HPV se utiliza dot blot, dot blot inverso, Southern blot, análisis de restricción de fragmentos (es el más fácil), secuenciación directa del ADN, amplificación anidada, polimorfismo estructural de cadena sencilla o inmunoensayo enzimático de oligonucleótidos. De todos ellos, los métodos de tipificación genómica más adecuados para un laboratorio general es el inmuno ensayo enzimático con oligonucleótidos con sondas específicas de cada genoma, aplicado a los productos de amplificación de PCR, una técnica que puede ser automatizada en su totalidad y cuyos resultados pueden ser valorados en un espectrofotómetro en menos de 6 horas²².

En el caso de biopsias de pequeño tamaño, puede ser difícil distinguir un carcinoma verrucoso de una verruga vulgar Las técnicas inmunohistoquímicas apoyan el diagnóstico de verruga si se detecta la proteína del virus en el núcleo de los queratinocitos. La amplificación del ADN viral mediante PCR proporciona el método más sensible para la detección del papilomavirus.

También se emplea PCR en el diagnóstico de numerosos hongos⁹⁸ y en el estudio de hongos como Malassezia furfur en la dermatitis atópica⁹⁹.

La elección entre técnicas de cultivo convencionales y análisis moleculares vendrá determinado en parte por el entorno diagnóstico y clínico en que nos encontremos. La rapidez y sensibilidad que ofrecen los análisis con sondas moleculares tiene su contrapartida en su capacidad de detección de un único microorganismo en cada prueba (aunque también pueden utilizarse múltiples iniciadores o sondas) y por no poder ser aplicados a pruebas de sensibilidad microbiana.

APLICACIONES EN NEOPLASIAS

La metodología en la que se basa ha permitido el desarrollo de nuevas estrategias moleculares (análisis de fragmentos de restricción, detección de clonalidad en tejido linfoide, etc.)^100.Permite detectar células tumorales en sangre periférica (por ejemplo, antígeno específico prostático en el carcinoma de próstata) o recidivas de leucemia mieloide crónica tras trasplante de médula ósea¹⁰¹.

Reordenamientos clonales. Linfomas

En lesiones con un importante componente linfoide no neoplásico, como la dermatitis actínica crónica o reticuloide actínico, el principal diagnóstico diferencial es el linfoma cutáneo de células T La inmunohistoquímica puede ayudar en ocasiones, pues el infiltrado es predominantemente CD8 positivo. Sin embargo, sólo podemos descartar con mayor seguridad un linfoma T si realizamos el estudio del patrón de reordenamiento del gen del antígeno del receptor de células¹⁰².

Micosis fungoides

Los estudios del reordenamiento genético del gen del receptor B de células T y demuestran que la micosis fungoides es una proliferación clonal de células T ¹⁰³ . Las diferentes localizaciones de la enfermedad en el mismo paciente generalmente muestran idénticas bandas clonales, indicando que la enfermedad es monoclonal y sistémica en los pacientes con lesiones múltiples. El reordenamiento clonal del gen del receptor B de células T también se encuentra en la reticulosis pagetoide y la enfermedad de la piel laxa granulomatosa^l04.

Los estudios de reordenamiento genético han demostrado ser de gran utilidad en el diagnóstico de la afectación ganglionar mínima por micosis fungoides y para el diagnóstico de afectación sanguínea¹⁰⁴. En un 57% de pacientes con micosis fungoides (incluso en estadios precoces), en un 85% de síndrome de Sézary y en un 77% de linfomas cutáneos T pleomórficos, se identifican células T tumorales en sangre circulante mediante PCR¹⁰⁵

Aunque estos estudios podrían ser de ayuda en el diagnóstico inicial de la micosis fungoides y sobretodo del síndrome de Sézary mediante el análisis de linfocitos sanguíneos periféricos, hay que recordar que los reordenamientos clonales del gen del receptor B de células T ocasionalmente aparece en el ADN de linfocitos periféricos sanguíneos de pacientes sin neoplasias linfoides, como en la mononucleosis infecciosa aguda o en biopsias de piel de papulosis linfomatoide y en la pitiriasis liquenoide y varioliforme aguda (enfermedad de Mucha-Habermann). Adicionalmente, conviene recordar que se describe pseud omonoclonalidad en algunos casos de psoriasis y eccema, debida a la alta sensibilidad de estas técnicas que detectan clonas de células T dominantes (pero no realmente clonales) en estos procesos inflamatorios. Por lo tanto, es necesario realizar análisis repetidos de los casos monoclonales para confirmar la monoclonalidad de los productos de PCR¹⁶.

Los estudios de reordenamiento genético pueden utilizarse también en el diagnóstico de micosis fungoides inicial en las biopsias de piel, puesto que casi todas las dermatosis inflamatorias muestran una configuración de línea germinal para el receptor B de células T¹⁰⁴

Estudiando mediante PCR el gen del receptor TCR-gamma, se demuestra monoclonalidad en un 60% a 72% de los casos de micosis fungoides¹⁰⁵. Por lo tanto, su utilización para el diagnóstico diferencial entre linfoma cutáneo o infiltrados de células T reactivas es limitado.

En la mayoría de los pacientes con micosis fungoides, se encuentran anomalías citogenéticas en las células analizadas de las biopsias en las que la afectación por la neoplasia es sospechada, incluso en sitios en los que la afectación no puede ser probada morfológicamente. En contraste con muchos otros linfomas, no se detectan anomalías citogenéticas constantes en la micosis fungoides. Los estudios de bandeo de cromosomas muestran extensa heteroploidía. En un estudio se demostró anomalías numéricas de los cromosomas 11, 21 y 22, mientras que las anomalías estructurales eran más frecuentes en el cromosoma 1. Los pacientes con cambios cromosómicos más extensos tienden a tener una enfermedad clínica más avanzada. La formación clonal se asocia a un peor pronóstico. Los estudios citofotométricos de ADN también muestran una población de ADN aneuploide en los tejidos afectados de micosis fungoides¹⁰⁶.

Linfoma anaplásico de célula grande CD30⁺

Aunque los tumores de células-T con frecuencia muestran reordenamientos de los genes del receptor de células-T (TCR) (50 a 60%) y los tumores de células B reordenamientos para los genes de inmunoglobulinas, algunos linfomas anaplásicos de célula grande carecen de reordenamientos en ninguno de los genes, muestran reordenamientos en ambos tipos de genes, o muestran una discrepancia entre inmunofenotipo y genotipo. La ausencia de reordenamiento del TCR no descarta un origen en células T¹⁰⁴.

Una anomalía cromosómica característica detectada en algunos casos de origen en célula T o indefinida es translocación t(2;5) (p23;q35). La frecuencia de t(2;5) es de un 12% en las series de adultos y un 50% en las series de niños o adultos jóvenes. En el linfoma primario cutáneo de célula grande CD30⁺ sólo ocasionalmente se identifica t(2.5)¹⁰⁴

Aunque la inmunorreactividad frente a la proteína p53 se detecta en el 80% de los linfomas anaplásicos de célula grande, son raras (6%) las alteraciones estructurales del gen p53. Las anomalías del gen c-myc: (mutación, translocación o amplificación) se detecta en un 32% de los casos, y los casos positivos frecuentemente son de línea B. Por otra parte los genes bcl-2, K-ras, N-ras y H-ras no están estructuralmente alterados¹⁰⁴.

Todos los linfomas anaplásicos de células T primarios cutáneos expresan el gen "homeobox" C5 (H0XC5). También se ha descrito la presencia de secuencias provirales de HTLV-1 en linfomas anaplásicos de célula grande CD30⁺ cutáneos en áreas no endémicas¹⁰⁴.

En los pacientes VIH positivos, los linfomas cutáneos frecuentemente son linfomas de células T tipo células grandes CD30⁺, y en estos se identifica el virus de Epstein-Barr en un 73%^107.

Linfoma/leucemia de células T del adulto

Con frecuencia afecta a la piel, donde puede recordar una micosis fungoides (son frecuentes los microabscesos de Pautrier) o un linfoma anaplásico de célula grande Ki-1⁺. Se identifica reordenamiento clonal de los genes de los TCR y se detecta el genoma del virus HTLV (human T-cell lymphotropic virus)-1 integrado en todos los casos (66 ^108).

La infección por HTLV-1 se ha asociado, asimismo, a varias entidades no neoplásicas, como trastornos neurodegenerativos crónicos, mielopatía (paraparesia espástica tropical) y uveítis y dermatitis infecciosa en niños¹⁰⁹

Linfoma de células T tipo linfadenopatía angioinmunoblástica (AILD)

Su diagnóstico diferencial incluye la micosis fungoides cuando infiltra la piel. Muestra reordenamiento clonal de genes TCR en el 75%, y de IgH en un 10%. Puede identificarse trisomía 3 y/o 5. Es el segundo linfoma T periférico que se asocia con mayor frecuencia (50%) al virus de Epstein-Barr (VEB), después del linfoma nasal T/NK. Se identifica ambos subtipos 1 y 2, del VEB, a veces en el mismo caso. Con hibridación in situ el VEB se identifica sólo en 5-20% de células T neoplásicas, observándose una mayor positividad en las células B reactivas¹⁰⁴.

Linfomas angiocéntricos cutáneos primarios

A diferencia de los linfomas angiocéntricos de células NK/T, que afectan al tracto respiratorio superior con o sin afectación cutánea secundaria, los linfomas angiocéntricos cutáneos primarios generalmente tienen un fenotipo de célula T CD3^+, CD4⁺ y rara vez expresan CD8 ó CD56. Es rara la asociación con virus Epstein-Barr y tienen un pronóstico más favorable. clínicamente no se diferencian significativamente de otros linfomas de células-T cutáneos puede mostrar angiocentricidad¹⁰⁴,

Sarcoma de Kaposi

Los estudios citogenéticos basados en el receptor de andrógenos (un locus polimórfico ligado al cromosoma X) en el sarcoma de Kaposi de la piel, demuestran que esta lesión es clonal ^110, y el estudio con PCR usando técnicas de microdisección demuestra que la infección por el virus del herpes humano 8 (VHH8) es específica de las lesiones cutáneas de Sarcoma de Kaposi y no se identifica en el tejido normal adyacente¹¹¹. El estudio de células mononucleares en sangre periférica mediante PCR en pacientes VIH positivos demuestra que el VHH8 aparece en un 52% de pacientes VIH positivos que han desarrollado un sarcoma de Kaposi, mientras que este virus sólo está presente en un 8% de pacientes que no tienen sarcoma de Kaposi. Sin embargo, en éste último grupo, más de la mitad(54,5%) de los pacientes con VHH8 desarrollaron posteriormente el sarcoma de Kaposi, frente a un 9,1 % de los pacientes en los que no se detectó VHH8 en sangre periférica ¹¹².

El análisis del virus HH8 es útil en el diagnóstico diferencial el sarcoma de Kaposi (clásico o asociado a SIDA) con otras entidades como el hemangioendotelioma fusocelular hemangioendoteliomakaposiforme, angiosarcoma, hemangiomas y tumores glómicos. Se ha descrito reacción positiva para VHH8 en 1 de 20 granulomas piogénicos estudiados ¹¹³.

Estudio de p53

El producto del gen supresor de tumor p53 es una proteína que se une al ADN y la pérdida o mutación de p53 tiene un papel fundamental en la carcinogénesis. El gen p53 humano está localizado en el cromosoma 17 (17p13). la proteína p53 es un elemento esencial en procesos celulares fundamentales, incluyendo la transcripción de genes, reparación de daño en el ADN, control del ciclo celular, estabilidad genómica, separación cromosómica, senescencia y apoptosis¹¹⁴.

Se ha descrito 3 tipos de alteraciones genéticas de la función de la proteína p53: (i) Deleción parcial o total del gen, que anula la función de supresión tumoral y contribuye al desarrollo de tumores (ii). Un efecto negativo dominante en algunas mutaciones críticas que suprimen la función de la proteína p53 salvaje al inhibir la actividad de unión al ADN y por lo tanto su función transactivadora. (iii). Ciertas mutaciones de p53 (como la proteína 175His p53) que parecen tener su función aumentada, se asocian a un aumento del potencial cancerígeno y metastásico³.

El patrón de mutación del gen p53 puede ser utilizado como marcador diagnóstico de carcinomas múltiples primarios y secundarios, y así facilita la distinción entre múltiples carcinomas primarios o la existencia de metástasis¹¹⁵. Las mutaciones adquiridas de p53 constituyen el defecto genético aislado más frecuente en tumores (presente en más del 50%)^116. Se ha identificado y clasificado más de 5,000 mutaciones, disponibles en bases de datos accesibles a través de redes informáticas¹¹⁷. Las mutaciones producidas por rayos UV son tan características que se denominan mutaciones con la «Firma» UV Las mutaciones detectadas en los tumores cutáneos que aparecen en el xeroderma pigmentoso ocurren en el segmento no transcrito lo que implica una reparación preferencial de las lesiones por UV en el segmento transcrito en tejidos humanos³.

Varios estudios de alteraciones de p53 a nivel genético implican a agentes ambientales específicos, como la radiación ultravioleta, en la etiología del cáncer de piel^118.

La radiación ultravioieta B (290-320 nm) induce mutaciones en p53 a través del daño en el ADN, que han sido detectadas tanto en el carcinoma epidermoide como en el queratoacantoma¹¹⁹. A diferencia del carcinoma de colon, en el que la mutación de p53 es un hecho tardío, la mutación de p53 parece ser un evento precoz en el desarrollo de queratosis actínica, carcinoma epidermoide y epitelioma basocelular^120-25

Las mutaciones de p53 se encuentran más frecuentemente en carcinomas epidermoides infiltrantes (90%) y epiteliomas basocelulares (56%) que en el carcinoma in situ (enfermedad de Bowen) o microinfiLtrante ^{126, 127}.

Se ha encontrado correlación entre la frecuencia de mutaciones de p53 en biopsias de piel normal expuesta a rayos ultravioleta y el riesgo de desarrollo posterior de epitelioma basocelular^l28.

En los pacientes con xeroderma pigmentoso grupo C la frecuencia de mutaciones de p53 en sus tumores cutáneos es mucho más alta (85%) que en los pacientes de xeroderma pigmentoso que no pertenecen a ese grupo (33%) ¹²⁹ .

Además de la radiación ultravioleta, hay otros factores involucrados en la etiología del carcinoma epidermoide de piel y el queratoacantoma, como la exposición a hidrocarburos y la infección por HPV como lo demuestra la mayor incidencia de estos tumores en el contexto de infección por HPV en enfermos trasplantados con inmunosupresión. Las similitudes encontradas a nivel molecular han llevado a muchos autores a concluir que el queratoacantoma podría ser considerado una variante del carcinoma epidermoide bien diferenciado¹¹⁹.

En el cáncer de piel relacionado con arsénico, el porcentaje de mutaciones del gen p5 es alto (39% en enfermedad de Bowen y 56% en carcinoma epidermoide), excepto en el epitelioma basocelular (29%) y las mutaciones son diferentes a las observadas en la radiación UV¹³⁰.

En algunos tumores (carcinoma de próstata o de mama), la presencia de mutación de p53 se asocia a un peor pronóstico¹³¹,

Las mutaciones en p53 pueden estar situadas en la línea germinal (síndrome Li Fraumeni), confiriendo un riesgo significativamente alto de múltiples tipos de cáncer primarios en los portadores de esta mutación ^132,133.

La mayoría de queratoacantomas expresan p53 mutante, lo cual no contradice la posibilidad de regresión tumoral de esta lesión, un hecho mediando por mecanismos inmunológicos, sobreexpresión de oncogenes H-ras, cmyc e, incluso, p53 salvaje¹¹⁹.

La presencia de mutaciones en p53 también puede ser utilizada en la valoración de márgenes en la extirpación de neoplasias ("márgenes moleculares"), pues la valoración molecular de p53 permite afinar aún más en la predicción de las recurrencias locales del tumor¹³⁴, aunque algunos estudios inmunohistoquímicos no confirman estos hallazgos¹³⁵.

En las lesiones premalignas de los genitales masculinos no parece existir relación entre la expresión proteica de p53 y la infección por el HPV; en esta localización p53 podría no participar en los estadios iniciales de la carcinogénesis ^136.

Mientras que el estudio genético de p53 basado en biología molecular del ADN permite detectar casi todos los tipos de mutaciones, la información morfológica se pierde (excepto cuando se realiza PCR in situ) y la técnica es susceptible de contaminación por células epiteliales benignas, estromales o inflamatorias que se encuentran presentes en la muestra, sobre todo cuando éstas se seleccionan durante el examen macroscópico ¹³⁷.

Otro gen supresor de tumor, p16 (MTSI) también se encuentra mutado o delecionado en un amplio espectro de tumores malignos¹³⁸, entre los que destacan las pequeñas deleciones homocigotas en el melanoma y el carcinoma epidermoide. Además, el p16 está frecuentemente inactivado en las lesiones premalignas¹³⁹.

El p21 WAFI es un gen supresor, que codifica un inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina relacionada con p53, que relacionado con los estadios iniciales de la aparición de palpilomas cutáneos, pero no parece jugar un papel significativo en la progresión maligna¹⁴⁰

En el dermatofibrosarcoma protuberans, hay evidencias que sugieren que las alteraciones en la vía de la p53, como la sobreexpresión de p53 por un gen mutado y la sobreexpresión de mdm2, una proteína relacionada con p53, participan en la transformación fibrosarcomatosa y en un comportamiento más agresivo localmente¹⁴¹.

Se describe también mutaciones de p53 en un 21 % de los melanomas, asociadas con la exposición a UV aunque en estos tumores es posible que estas mutaciones sean un fenómeno tardío y no participe en la génesis del tumor ^142.

Las mutaciones de p53 observadas en algunos linfomas cutáneos primarios parecen indicar que también en estos tumores la radiación ultravioleta podría participar en la oncogénesis de estos tumores y en la progresión de la micosis fungoides de estadio placa a estadio tumor¹⁴³, pero no parece intervenir en la transformación de la micosis fungoides/síndrome de Sézary en linfoma de célula grande¹⁴⁴.

Gen hptc (patched)

El gen humano hptc es homólogo al gen ptc (patched) de la Drosophila (gen parcheado de la polaridad de segmento), otro gen supresor tumoral que controla la actividad de crecimiento y diferenciación. Su función es opuesta al gen erizo sónico (Sonic hedgehog, Shh) que expresa una proteína de señalización que induce el crecimiento celular y la diferenciación³. En la transducción de la señal ptc participa otro gen similar al descrito en la Drosophila llamado smoothned (vSmo) que codifica una proteína de membrana con características de receptorG. La proteína ptc forma un complelo con vSmo y serviría de receptor para Shh en el mecanismo de señalización celular¹⁴⁵.

El gen ptc humano se localiza en el cromosoma 9q22,3, en el mismo lugar que se ha localizado el síndrome del epitelioma basocelular nevoide o síndrome de Gorlin, un trastorno autosómico dominante caracterizado por múltiples epiteliomas basocelulares que aparecen a partir de la segunda década de la vida, sobre todo en piel expuesta al sol. Esta enfermedad también incluye trastornos del desarrollo (alteraciones faciales, en costillas, y a veces polidactilia y sindactilia y espina bífida), fibromas de ovario y de corazón, quistes cutáneos y mandibulares y, en sistema nervioso central, meduloblastomas y meningiomas³. Los pacientes con síndrome de Gorlin tienen mutaciones genómicas y esporádicas en el gen ptc. lo que sugiere que estas mutaciones son la causa última de esta enfermedad¹⁴⁶.

La alteración en la regulación del mecanismo de señales de prc, posiblemente relacionada con mutaciones originadas por la radiación por UV-B, es una característica general de los epiteliomas basocelulares, tanto esporádicos como familiares, como lo demuestran los estudios de hibridación in situ, que muestran una sobreexpresión de ARNm de ptc¹⁴⁷.

También se ha descrito la mutación del gen humano Shh o de otros genes Hh en el epitelioma basocelular^l48.

El gen ESS 1 (epitelioma escamoso múltiple autocurativo), localizado en el cromosoma 9q.31 parece participar también en la inducción del carcinoma epidermoide de piel 149.

Familia ras

Los protooncogenes H-ras, K-ras, y N-ras codifican proteínas de 21 kDa que comparten un 70% de secuencia homóloga^l50. Están localizados en la cara interna de la membrana celular y participan en la transmisión de señales uniéndose a GTP Las mutaciones que activan los genes ras son menos frecuentes en La piel humana que las mutaciones del gen p53, identificándose en un 22% de casos de cáncer de piel¹⁵¹. Sin embargo, en el cáncer de piel que aparece en los pacientes con xeroderma pigmentoso se identifica con mayor frecuencia (53%) de mutaciones de genes ras.

Los modelos experimentales demuestran la existencia de mutaciones en genes ras en cáncer de piel inducido por radiación UVIII.
Las mutaciones ras son también más frecuentes en los melanomas asociados a exposición solar

Genes GADD (parada en la maduración por daño en ADN)

Los nevus melanocíticos son muy positivos para los genes GDA y suelen ser negativos para p53, excepto los nevus displásicos que muestran mayor expresión de p53 y menos expresión de GADD34 y GADD 153¹⁵³.

bcl-2

En el epitelioma basocelular se ha detectado un marcado incremento en la expresión de la proteína bcl-2, que podría incrementar el número de células proliferantes al inhibir la apoptosis⁵⁴.

En el queratoacantoma, la apoptosis representa un mecanismo clave en la regresión, demostrado mediante una escasa expresión de bc1-2¹⁵⁴, un oncogén que evita que las células entren en apoptosis frente a una fuerte expresión del antígeno sanguíneo relacionado con la apoptosis Le(Y)¹⁵⁵.

El gen bcl-2 está activado en algunos linfomas B, pero no en el linfocitoma cutis benigno⁵⁴.

Moléculas de adhesión

La expresión de E-caderina está reducida focalmente en el epitelioma basocelular, lo que podría contribuir a las anomalías de la superficie celular asociadas con la invasión e infiltración del tumor¹⁵⁶

El bajo potencial metastásico de los queratoacantomas se correlaciona con la fuerte expresión de vinculina, una proteína de la unión tipo adherens junction también relacionada con su escasa capacidad infiltrante¹⁵⁷, y el gen supresor de metástasis nm23¹⁵⁸

Anomalías cromosómicas

En los linfomas, la presencia de translocaciones puede ser analizada incluso en tejidos incluidos en parafina, lo que permite el estudio enfermedad mínima residual y la distinción entre recurrencias y los nuevos tumores¹⁵⁹.

ENFERMEDADES HEREDITARIAS

La PCR es muy útil en las enfermedades originadas por mutaciones puntuales.

Se ha descrito más de 20 mutaciones en el gen asociado a la fibrosis quística (el regulador de conductividad transmembrana de la fibrosis quística). Sin embargo, la anomalía más frecuente, presente en el 80% de los portadores, es la deleción de 3 pares de bases que originan la pérdida de un único aminoácido de fenilalanina en la posición 508 (Delta-F508). La detección de esta alteración fácil utilizando preamplificación de la secuencia lindante mediante PCR, que incluso puede ser automatizada 160.

Sin embargo, en algunas familias, en las que la naturaleza exacta del defecto es desconocida, linkage analysis es necesario, a pesar de sus limitaciones.

En el caso de enfermedades atribuibles a defectos en múltiples genes, su demostración es más difícil. Por ejemplo, en la enfermedad vascular coronaria, las mutaciones en los genes del receptor de LDL y de ApoB, así como los polimorfismos de los loci ApoE y Apo(a) pueden contribuir conjuntamente al riesgo161.

En el xeroderma pigmentoso, un término que incluye varias enfermedades distintas, todas ellas caracterizadas por un defecto en la reparación del daño en el ADN inducido por radiación ultravioleta162, el daño por rayos ultravioleta afecta a muchos genes y cromosomas. Uno de ellos es el oncogén N-ras, cuyo codón 6l es sensible a la radiación ultravioleta. Esta forma mutada del gen es capaz de producir tumores163. también el gen supresor p53, amba mencionadojuega un importante papel en la aparición de carcinomas epidermoides en esta enfermedad. El gen del xeroderma pigmentoso A se localiza en 9q22,3, la misma región (9q22,3-q31) que el gen del síndrome de epitelioma basocelular nevoide (NBCCS)118.

En la eritroqueratodermias (como la queratodermia palmoplantar o la eritroqueratodermia simétrica progresiva) se ha detectado mutaciones en el gen loricrina 164.

El análisis de mutaciones en el ADN mitocondrial mediante PCR parece ser un marcador útil de la exposición acumulada a rayos ultravioleta, y se ha utilizado como marcador de la relación entre la edad cronológica y "foto-edad" de la piel. Al parecer las mutaciones aparecen más en dermis (fibroblastos) que en epidermis, lo que concuerda que la ausencia de estas mutaciones en tumores epidérmicos165.

Las alteraciones del ADN mitocondrial también puede conllevar anomalías en el pelo y erupciones cutáneas pigmentadas, como se ha demostrado en pacientes con trastornos mitocondriales166.

En el edema angioneurótico hereditario es una enfermedad autosómica dominante causada por mutaciones que reducen la producción de inhibidor de el funcionante, y que conlleva a la producción de bradiquinina y subsiguiente edema de superficies cutáneas y mucosas. En el cribado de mutaciones para detectar esta enfermedad se ha observado que participan secuencias del genoma sensibles a errores de replicación, denominadas repeticiones invertidas imperfectas (cuasi-palíndromo)167.

El albinismo ha sido extensamente estudiado y se conoce la existencia de múltiples mutaciones en cada una de sus variantes. La Tabla 5 recoge algunos de los genes implicados en estos síndromes168.

ENFERMEDADES AUTOINMUNES

La tipificación HLA también es muy útil para detectar alelos específicos de loci HLA clase II asociados a enfermedades autoinmunes severasl.

En haplotipo ancestral 8,1 (HLA?A1, C7, B8, C4AQ0, C4B1, DR3, DQ2) se asocia a un síndrome de inmunodeficiencia adquirida acelerada por el VIH, susceptibilidad a diabetes insulinodependiente, lupus eritematoso sistémico, dermatitis herpetiforme, inmunodeficiencia común variable, deficiencia de IgA, miastenia gravis y otras entidades. Los genes de susceptibilidad para VIH, diabetes insulinodependiente y miastenia gravis se han localizado en la porción central del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC), entre los genes del HLA?B y el factor de necrosis tumoral o los del complemento169.

En las enfermedades cutáneas con formación de vesiculas subepidérmicas los cambios histopatológicos son muy similares entre ellas, por lo que es necesaria la utilización de técnicas específicas para un diagnóstico más específico. La alteración en los componentes de la membrana basal, que origina una pérdida entre la adherencia de la epidermis y la dermis, puede ser debida a mutaciones genéticas o a un ataque por autoanticuerpos. Algunos de los antígenos de la membrana basal que son la diana de reacciones autoinmunes son los antígenos del penfigoide ampolloso localizados en la porción superior de la lámina lúcida/hemidesmosoma (BP230 ó BPAgl y BP 180 ó BP Ag2 o colágeno tipo XVII), habiéndose descubierto también autoanticuerpos frente a diferentes epitopos de BPAg1 en la dermatosis ampollosa IgA lineal11.

DETERMINACIÓN DE COMPATIBILIDAD E IDENTIDAD

La PCR puede ser utilizada para amplificar selectivamente una porción del gen HLA (human leukocyte antigen) DQalfa, o el receptor de LDL (low-density lipoprotein). En ambos casos se trata de un locus muy polimórfico del genoma humano y para los que existen algunos kits comerciales para su detección. Esto permite comprobar la correcta identidad de los tejidos de pacientes en casos dudosos por no existir correlación entre los hallazgos histológicos y el contexto clínico 173.

En trasplantes, la tipificación de HLA tradicionalmente se realiza mediante análisis inmunológicos. Sin embargo, la aplicación de análisis genéticos permite una mayor resolución174.

VARIANTES DE PCR175,80:

RT-PCR (reacción encadena de polimerasa-transcripción inversa)

Se utiliza para la detección y amplificación de ARN. Permite estudiar la expresión de determinados genes (su traducción a proteínas). En primer lugar se extrae el ARNtotal de las células en estudio y se separa la fracción correspondiente al mensajero (ARNm). Tras purificarlo el ARN se transcribe a ADN mediante una transcriptasa inversa, por cada molécula de ARNm se sintetiza una molécula de cADN monocatenaria que posteriormente se ha de convertir en bicatenaria utilizando una ADN polimerasa (la rTth ADN polimerasa de Thermus thermophilus es un enzima recombinante y termoestable que actúa como transcritasa inversa y como ADN polimerasa simultáneamente). A partir de aquí se aplica la técnica de PCR lo que permite una detección de la expresión de ARNm mucho más sensible que con Northern blot o con hibridación in situl76. La,80. secuencia del fragmento amplificado se determina mediante secuenciación automática de ADN. Existen diversos kits comerciales, como Gene Amp de ARN-PCR (Pekin-Elmer, Alemania) que pueden ser utilizados para RT-PCR,50,80

Aplicación en dermatología

La RT-PCR puede ser aplicada al ARN extraído de mínimos volúmenes de sangre o en material archivado como extensiones en laminillas así como en secciones de tejidos. Por ello, la RT-PCR es muy útil para detectar la presencia de virus ARN (como el virus del sarampión)177 y el análisis citogenético molecular de translocaciones cromosómicas176.

Esta técnica se puede usar por ejemplo para detectar la expresión proteica de antígeno específico prostático en células (detección de micrometástasis o células tumorales circulantes)178.

Las translocaciones en los tumores de piel y partes blandas son detectadas mediante RT-PCR (Tabla 6). En el liposarcoma mixoide y en sus variantes pobremente diferenciadas, la translocación t(12,16) origina un gen de fusión entre el gen CHOP gene y el gen FUS; y en los lipomas, el gen HMGI-C se reordena por alteraciones estructurales que afectan a la región 12q 14-15, un hecho que puede ser utilizado en el diagnóstico diferencial de este tipo de tumores 179,180.

Los estudios genéticos en el angiolipoma subcutáneo, una lesión de partes blandas caracterizada por ser generalmente múltiple, con predilección por el sexo masculino y a veces hereditario, demuestran que su cariotipo es siempre normal, lo que los distingue claramente de los lipomas, lipomas fusocelulares y pleomórficos, lipoblastomas e hibernomas, que casi siempre muestran alteraciones cromosómicas clonales181.

En el dermatofibrosarcoma protuberans y el fibroblastoma de células gigantes se observa una translocación t(17,22), que origina una fusión entre el gen COLIAI del cromosoma 17, que codifica la proteína colágeno tipo I al (COLIA I), con el gen PDGFB del cromosoma 22, que codifica la cadena B del factor de crecimiento derivado de plaquetas. La proteína quimérica resultante COIA1/PDGFB, tiene actividad PDGFB que parece jugar un papel esencial en la oncogénesis de estas dos neoplasias, y el distinto comportamiento clínico de éstas se debe a otros factores adicionales182.

En algunas familias con incidencia elevada de melanoma cutáneo se ha localizado el gen responsable en el cromosoma 9p21, que codifica la proteína p16INKA4a, y actúa como un gen supresor de tumor pues es un inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina y complejos de ciclina (como CDK4-ciclina DI) que fosforilan la proteína del retinoblastoma. También se ha descrito mutación de CDK4 (que puede actuar como un oncogén) en algunos melanomas183.

La identificación de células tumorales circulantes en la sangre periférica de pacientes con melanoma es posible mediante la utilización de RT-PCR para analizar transcripciones (ARNm) de proteínas asociadas al melanoma (tirosinasa, Melan-A/ MART-1, MAGE-3, gp100, y p97). En el estadio II un 23,8% y en el estadio IV un 37,5% de los pacientes presentan muestras positivas para al menos uno de esos marcadores en RT-PCR. Aunque el análisis de la proteína S-l00 en suero (LIA análisis de inmunoluminometría) parece ser más sensible, RT-PCR podría ser útil para la detección de micrometástasis en tejidos184.
En las enfermedades congénitas o degenerativas de la piel se ha descrito numerosas alteraciones cromosómicas (Tabla 7).

Una de las causas de síndrome hiper IgE, en pacientes con historia prolongada de eccema, abscesos por estafilococos y neumonía recurrente son las alteraciones cromosómicas, como la pentasomía X, aunque el mecanismo de estos síndromes hiper IgE es desconocida187.

El estudio de ARNm y de su expresión proteica se utiliza para conocer mejor los mecanismos inmunológicos y de la inflamación. De esta forma, en sujetos atópicos, se ha comprobado que la eotaxina juega un papel importante en la reclutación de eosinófilos en las primeras 6 horas, mientras que la eotaxina-2 y la proteína quimifiláctica para monocitos-4 (MCP-4) participan a las 24 horas188. Por otra parte, en la dermatitis atópica se observa una expresión elevada de ARNm de interleuquina-4, sobre todo en las lesiones agudas, mientras que en las lesiones crónicas se observa un mayor número de células positivas para ARNm de IL-5, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GMCSF) e IL-12(p40), conclusiones similares se obtienen tras el estudio mediante hibridación in situ de los receptores de estas citoquinas. Además, se ha observado un marcado incremento de células positivas para el ARNm de receptores GM-CSFRalfa y IL-2Rbeta2 en la piel con psoriasis189.

En el liquen plano, el estudio de ARNm de interleuquina 6 e interferón gamma ha demostrado que estas citoquinas proinflamatorias se producen en el liquen piano tanto por linfocitos T activados como por queratinocitos alterados, lo que podría hacer perdurar la lesión190.

También se ha empleado RT-PCR en el estudio de citoquinas (interleuquina{IL}-2, IL-4 y IL-10) en la dermatitis por hipersensibilidad de contacto, comprobándose un nivel elevado en estas reacciones, mientras que en la dermatitis por mecanismo imtativo no se detecta elevación en el ARN de estas citoquinas191.

En sangre periférica y en biopsias de piel, es posible estudiar el patrón de respuesta inmunológica en las reacciones asociadas a daño tisular en la lepra lepromatosa mediante el estudio de citoquinas por ELISA y RT-PCR del ARNm de céiulas mononucleares. Así, se ha observado que los pacientes de lepra lepromatosa sin reacciones tienen un patrón T helper2 (Th2) y Th0, mientras que los enfermos con reacciones muestran una respuesta tipo Th 1, con presencia de interferón gamma y ausencia de interleuquina 4 y IL-12 p4O192.

La psoriasis es una enfermedad cutánea mediada por células Th 1, que se ha asociado a infecciones por estreptococo beta-hemolítico del grupo A, el cual presenta péptidos (M6), cuyo ARN puede ser detectado mediante RTPCR, con secuencias de aminoácidos similares a las queratinas epidérmicas humanas193.

En el eritema nodoso, la expresión de genes de las citoquinas IL-2 e interferón-gamma en biopsias de piel y en sangre periférica indica una respuesta inmune tipo Th 1, independientemente del agente causal194.

Utilización terapéutica

En el estudio de nuevas dianas para la inmunoterapia del melanoma, se estudia la expresión de ARNm de determinados antígenos, como el Melan-A196, para comprobar que este producto sea específico de células melánicas, lo que a su vez proporciona una herramienta útil de diagnóstico, gracias al desarrollo de anticuerpos monoclonales aplicables a tejido en fresco y fdado en parafina, muy útiles para detectar micrometástasis en el estudio de ganglios linfáticos centinelas197.

En el estudio de enfermedades inflamatorias de la piel, puede utilizarse RT-PCR para valorar el efecto y mecanismo de acción de determinados fármacos. Así, se ha demostrado que los corticosteroides tópicos disminuyen la expresión de ARNm de E-selectina, segregada por las células endoteliales en el proceso inflamatorio198.

El análisis de citoquinas mediante RT-PCR en alopecia areata demuestra que el patrón de citoquinas es Th1 y se modifica (aumento de IL-2, IL-8, IL- 10, y factor de necrosis tumoral alfa) durante el tratamiento inmunoterápico tópico (difenilciclopropenona), por lo que el tratamiento con IL-10 recombinante podría ser útil en estos pacientes199.

PCR asimétrica

Produce fragmentos de ADN de cadena simple al utilizar los dos cebadores necesarios a concentraciones molares distintas en una relación entre 50/1 y 100/1. así se produce ADN de doble cadena en cantidad exponencial hasta que se agota el cebador minoritario y luego sólo se produce la cadena que hibrida con el ADN que se encuentra en exceso, produciéndose a partir de entonces de forma lineal. De esta forma el producto de PCR contiene 10 a 20 veces más de ADN monocatenario que de ADN bicatenario. Recuperando exclusivamente el ADN monocatenario se puede utilizar para una secuenciación directa con la técnica de Sanger 200,80

PCR anclada

Permite la amplificación de ADN o ARN cuando sólo se conoce el extremo 3'de la secuencia de interés. Por ejemplo, el extremo 5' de la región a amplificar es artificialmente creado añadiendo una cola de nucleátido definida utilizando la enzima terminal deoxinucleotidiltransferasa (Tdt). Esta cola, a su vez sirve de secuencia que ahora puede ser reconocida por un iniciador 5'. A partir de aquí se realiza PCR convencional201.


PCR anidada ( "meste" PCR)

Se realizan dos PCR consecutivas de 25 a 30 ciclos cada una. En la primera se utilizan un par de cebadores llamados externos; en la segunda se usan cebadores complementarios a secuencias de ADN contenidas en los fragmentos que se amplificaron en la primera PCR (cebadores internos) que flanquean una región central que es la que queremos amplificar202,80 . La idea que persigue esta técnica es que los productos de la primera amplificación son un molde ideal para la segunda amplificación, mucho mejor que el ADN genómico original203.

Dada su enorme sensibilidad, uno de los peligros de esta técnica es la contaminación, por lo que su utilización es difícil en laboratorios de rutina204.

En el estudio de los genes IgH, el ADN genómico puede ser amplificado utilizando oligonucleótidos específicos para la región variable (FR2A) y de unión (LJH). La secuencia obtenida es comparada con la secuencia VH de línea germinal utilizando programas informáticos como HUSAR84.

Aplicación en dermatología

Este sistema sirve para aumentar la sensibilidad y especificidad de la reacción y se utiliza cuando partimos de cantidades muy bajas de ADN problema.

Se ha diseñado protocolos de consenso específicos para la detección de un amplio espectro de HPVs cutáneos no genitales o asociados a epidermodisplasia verruciforme205.

En tejidos incluidos en parafina, el estudio de productos de PCR anidada obtenidos con iniciadores que codifican una proteína de 65 Kca común a todas las micobacterias, se ha observado que en un 80% de las lesiones cutáneas de sarcoidosis, una enfermedad granulomatosa sistémica, se identifica ADN de micobacterias. Mediante el análisis del patrón de enzima de restricción en estos productos de PCR (PCR/REPA) se ha subclasificado las micobacterias detectadas en estos tejidos y han sido M. tuberculosis complex, M. avium-intracellulare y M. kansasii206.

Con la variante "anidada" de PCR-electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización se detecta hasta un 90% de clonalidad en el receptor TCR-gamma en lesiones de micosis fungoides en todos los estudios207.

Sin embargo, puesto que en un 6% de las biopsias de piel con procesos inflamatorios benignos (incluyendo pitiriasis liquenoide y varioliforme aguda o parapsoriasis de pequeña placa entre otros) también presentan monoclonalidad de células T, debe realizarse siempre una correlación entre el estado de la clonalidad con las características morfológicas e inmunofenotípicas que ayuden a diferenciar los infiltrados linfocitarios benignos de los linfomas cutáneos207.

PCR semianidada ("semi-nested' PCR)

Es una PCR anidada en la que sólo se utiliza uno de los cebadores internos. El método no añade mucha especificidad pero en ciertas aplicaciones añade la suficiente especificidad para conseguir el producto PCR deseado203. De esta forma, para la detección de genes IgH reordenados clonalmente puede utilizarse PCR semi-anidada 84.

"Drop-In/Drop-Out Nested" PCR

Esta técnica se basa en incluir cebadores internos (anidados) con el punto de fusión significativamente más bajo que los cebadores externos, lo que evita que esos cebadores internos se hibriden (annealing) durante la primera PCR. Con este método se evita la utilización de capas de aceite que de otra forma serían necesarias para separar los reactivos de las dos PCRs203.

PCR múltiplex

Consiste en hacer diversas amplificaciones en el mismo tubo de reacción colocando múltiples parejas de cebadores. Las secuencias a detectar han de estar lo suficientemente lejos unas de otras para que las amplificaciones no interfieran entre sí8O.

Esta técnica se utiliza en la detección del gen de la distrofina en la distrofia muscular de Duchenne; un gen enorme (de mas de 2 millones de pares de bases), que no es adecuado para ser estudiado mediante análisis indirecto, y que además presenta una marcada heterogeneidad en sus mutaciones208.

El análisis de sonda fluorogénica, desarrollado en 1997, es un método sencillo que puede ser aplicado a la detección de HPV y subtipos en varios tipos de muestras. La técnica se basa en la actividad 5'->3´ exonucleolítica de la Taq polimerasa que aumenta la señal de marcadores fluorescentes al liberarlos de las sondas especificas para esos genomas durante PCR múltiple. Esa fluorescencia puede ser detectada en un fluorómetro automático y se correlaciona con la cantidad de ADN de HPV presente en la muestra antes de la amplificación209.

"Touch-down" PCR

Es una reacción de PCR en dos partes. En la primera parte, que dura 20 ciclos, se empieza con una temperatura de hibridación elevada y se va disminuyendo hasta la temperatura de hibridación óptica; esto evita la formación de dímeros de cebadores en las primeras fases. Luego, en la segunda parte, se hacen otros 20 ciclos más a la temperatura de hibridación óptima para que se produzca cantidades masivas de ADN. Se utiliza cuando se trabaja con cebadores degenerados porque es difícil calcular la temperatura de hibridación óptima8O, también es útil cuando
no se ha determinado exactamente el grado de complementariedad del molde del cebador, pero esta técnica tiene algunos inconvenientes, como requerir una programación complicada, sobre todo en las máquinas equipadas para reducir automáticamente y progresivamente la temperatura en cada ciclo sucesivo203.

"Hot start" PCR

Consiste en empezar la PCR a una temperatura elevada. Antes de calentar la muestra ya se puede formar dímeros y uniones inespecíficas si la Taq polimerasa está presente. Para evitarlo se añade la Taq polimerasa en último lugar antes de comenzara ciclar, a una temperatura de 95°C80. Con la Amplitaq gold de Perkin-Elmers no es necesario este paso porque sólo se activa tras el Primer calentamiento16

PCR cuantitativa

Se utiliza un segundo objetivo dentro de la muestra que sirve de control interno para la síntesis de cADN y se basa en la competencia de los iniciadores por las dos secuencias objetivo. Es muy difícil y casi nunca se usa80

PCR "ín situ"

Consiste en realizar la PCR directamente sobre cortes de tejido o extensiones citológicas de forma que, posteriormente, se puede detectar los productos de PCR amplificados en el lugar donde se localiza el ADN (o ARN) original en la muestra, en lugar de utilizar un gel o una membrana80 En realidad este término se ha utilizado indistintamente para denominar dos técnicas diferentes:

PCR-hibridación in situ (PISH)

Consiste en realizar una PCR sobre el corte de tejido o la extensión citológica y después detectar el ADN amplificado mediante hibridación in situ con sondas complementarias marcadas colorimétricamente (avidina-biotina-peroxidasa).

Aunque técnicamente compleja, es utilizada para detectar la infección latente de VIH en cortes histológicos, por ejemplo, en ganglios linfáticos, músculo esquelético, o cérvix, en individuos portadores asintomáticos210.

Utilizando PCR hibridación in situ podemos detectar una única copia de genoma del virus del papiloma humano (HPV) en una célula determinada. Esto permite localizar células que contienen el virus en infecciones ocultas94. Utilizando PCR in situ, se ha detectado en ADN del HPV en algunas lesiones no diagnósticas en vulva y pene que fueron negativas para hibridación in situ, frecuentemente por estar ocultas tras una capa granulosa engrosada focalmente o por hiperqueratosis94.

Si el virus no puede ser detectado mediante PCR in situ, es muy improbable que esté presente en esa sección tisular Sin embargo, su complejidad y la pérdida de calidad del tejido después de sucesivos calentamientos y su elevado costo no hacen de la hibridación in situ una alternativa válida en el trabajo diario.

El virus del sarampión también puede ser localizado en tejido gracias a esta técnica311.

PCR in situ (en sentido estricto)

Consiste en realizar una PCR sobre el corte de tejido o la extensión citológica utilizando dNTPs (nucleótidos) o cebadores marcados colorimétricamente o con fluorescencia.

En ambos casos es necesario utilizar termocicladores con bloque térmico adaptado a la utilización de portas. Para evitar las uniones del ADN en el área de interés se utiliza irradiación ultravioleta (y se procede como en la PCR convencional) o se combina PCR con hibridación in situ, como hemos visto más arriba.

PCR de célula única

Se ha utilizado en el análisis preimplantación del gen de la fibrosis quística en una célula única extraída de un embrión de ocho células212, en el análisis de esperma y en el estudio de la expresión de genes en células de Reed-Sternberg213.

PCR-inmuno

Se emplean dos tecnologías, la detección basada en anticuerpos y PCR, La detección del antígeno por el anticuerpo se ve enormemente potenciada por la conjugación del sistema de detección del anticuerpo con un fragmento de ADN que posteriormente es amplificado mediante PCR. Esta técnica recuerda a ELISA (análisis inmuno absorbente ligado a enzima) y permite detectar incluso 10 femtogramos de proteína. Una variación de PCR-inmuno es el empleo de cromógenos unidos a uno de los cebadores o iniciadores, y la posterior determinación colorimétrica de la cantidad de producto generado214.

TÉCNICAS PARA DETECCIÓN DE MUTACIONES PUNTUALES

El cribado de mutaciones puede incluir la detección de alteraciones específicas y conocidas en la secuencia de nucleótidos en lugares concretos previamente determinados que contienen mutaciones, o puede realizarse la detección de mutaciones dispersas en varios lugares dentro de un segmento de ADN. Se ha empleado varias técnicas para identificar mutaciones en lugares previamente determinados, que con frecuencia se aplican tras la realización de PCR. Entre ellas, destacamos la hibridación de oligonucleátidos específica de alelo, la amplificación específica de alelo (ya sea a través de PCR con iniciadores que reconocen la secuencia alterada en sus extremos 3'o mediante la reacción en cadena de la ligasa), y procedimientos que crean o destruyen los lugares de restricción215.

La detección de mutaciones en lugares indeterminados del ADN puede ser realizada en segmentos que contienen una secuencia conocida o cuando no se dispone de información de la secuencia en la región que se está estudiando; esto último, por supuesto, supone una complicación considerable. Una solución posible es el rastreo de discordancias genéticas (genomic mismatch scanning)215.

MÉTODOS DE CRIBADO PARA LA DETECCION DE MUTACIONES NO CONOCIDAS (Rastreo del gen)

Según el nivel de información de que dispongamos, podremos utilizar cada una de las técnicas aquí descritas (Tabla 8). En general, SSCP (polimorfismo estructural de cadena simple) y DGGE (electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes) están indicadas para el cribado de mutaciones, es decir, para confirmar o no la existencia de mutaciones. Por otro lado, EMC (método de la rotura enzimática) y CCM (método de la rotura química) son útiles para conocer cuántas mutaciones existen y dónde están localizadas. Por último, la secuenciación nos permite conocer cuál es la mutación203

En un gran número de enfermedades genéticas se desconoce la secuencia de los genes e incluso su localización en los cromosomas. Para ello, se hace uso de las variaciones naturales que se producen en las secuencias de ADN (polimorfismos)216. Otros métodos están basados en el análisis de la secuencia del ADN. Un tercer grupo lo constituyen los métodos estructurales, basados en la movilidad alterada en electroforesis que presenta el ADN mutado, que tienen una sensibilidad moderada para detectar mutaciones raras en mezclas de fragmentos (alrededor de un 10% de fragmentos con mutaciones). Por último, se utiliza las técnicas basadas en el reconocimiento de discordancia de bases (sustancias químicas o proteínas que actúan en las bases no concordantes de ADN); puesto que estas técnicas trabajan con heterodúplex de fragmentos mutados y normales de ADN, no pueden ser aplicadas a fragmentos de ADN amplificados de células mutadas homocigotas, a diferencia de las técnicas estructurales. Esta limitación puede ser obviada añadiendo ADN normal a la mezcla de PCR203.

Secuenciación

Consiste en la identificación de la secuencia de bases de un determinado fragmento de ADN. Se utiliza para corroborar mutaciones detectadas con otras técnicas (PCR-SSCP DGGE, ASO, etc.). Existen dos formas de secuenciar un producto de PCR.

Secuencia directa

Se purifica el producto de PCR separando el producto amplificado de otros elementos presentes en la muestra (dímeros de oligonucleátido, sales, dNTPs, iniciadores Y Taq polimerasa)21. Una vez obtenida la cadena deseada, si el ADN es bicatenario hay que desnaturalizarlo por calor o con álcali (este paso no es necesario si tenemos ADN monocatenario como por ejemplo en el producto de PCR asimétrica217. La secuenciación directa es el estándar para la detección de sustituciones de una sola base. Aunque la técnica es algo complicada, hoy día puede ser automatizada218. Los resultados de la secuenciación directa pueden ser analizados: a. mediante la evaluación de los productos de PCR en electroforesis en gel; b. utilizando un escáner para estudiando la secuencia obtenida y valorándola con un software específico; y c. analizando la secuencia mediante un analizador de mutaciones es la posibilidad de definir "regiones calientes": en la secuencia que se presentan al usuario para su análisis visual, independientemente del estado de mutación que tengan. Esto es especialmente útil cuando se desea analizar una región determinada, como mutaciones específicas en una población mixta de VIH219.

Secuenciación indirecta

Se realiza tras la clonación del producto amplificado. La cionación del ADN consiste en introducir una secuencia del genoma en un vector, que puede ser bien un lago viral o bien un plásmido (los plásmidos están constituidos por ADN circular extracromosómico que está presente en las bacterias y que se replica de forma independiente del ADN bacteriano, generalmente son los portadores de genes de resistencia a antibióticos2l.

En ocasiones para clonar grandes fragmentos de ADN se utilizan los cromosomas artificiales de la levadura "YACs (yeast artificial chromosome)" en vez de los plásmidos. En los YAC es posible clonar fragmentos de ADN 1000 veces mayores que en los plásmidos21.

Los métodos clásicos de secuenciación son: enzimático, que requiere un ADN molde de cadena simple (como el bacteriófago M 13 o el plásmido PUC) y añadiendo a la mezcla del ensayo el fragmento mayor de la ADN polimerasa y los cuatro deoxinucleótidos trifosfato precursores marcados radioactivamente, y químico, que mediante reactivos químicos (metilación, ácido fórmico, piperidina , etc.) permite romper la cadena de ADN de modo selectivo en cada una de las posiciones ocupadas por las cuatro bases modificadas. Los vectores de clonación facilitan la obtención de ADN marcado21. Otro método es la secuenciación quimioluminiscente, en el que la secuenciación enzimática se lleva a cabo con un cebador estándar, no marcado, y tras la secuenciación y electroforesis se fijan los productos de la secuenciación a una membrana de nylon, la cual se híbrida con un oligonucleótido biotinilado complementario al cebador utilizado. Actual mente, estos protocolos están controlados por secuenciadores automáticos, que proporcionan gran rapidez y comodidad, incrementando la eficiencia de la secuenciación21.

Aplicación en dermatología

Este método permite disponer de un método sensible y rápido para el cribado de mutaciones de p53 en el estudio de cáncer de piel inducido por radiación UV220.

Más de un 50% de pacientes con dermatitis atópica tienen test cutáneo e IgE específica positivos para Malassezia furfur. Este hongo es capaz de producir un amplio abanico de proteínas que fijan IgE. Para valorar la participación de estos componentes en la enfermedad se ha clonado los alergenos de M. furfur, se ha secuenciado los insertos y se ha elaborado proteínas recombinantes en fagos Escherichia coli. De esta forma se ha identificado dos genes: Mal f5, similar al identificado en Aspergillus fumigatus, y Mal f6, muy parecido a la ciclofilina22l. En el caso de M furfur 2 y M furfur 3, sus secuencias son similares a las proteínas de la membrana de peroxisoma de Candida boidinii y un aiergeno de Aspergillus fumigatus, AsP f399.

La secuenciación es el método de elección para monitorizar cambios lentos en una determinada secuencia a lo largo del tiempo, por ejemplo, la progresión de la resistencia a AZT con el tiempo, debido a mutaciones del VIH-1203.

El gen que origina la enfermedad de Darier codifica una bomba de calcio, según se ha comprobado tras análisis de secuencia en un cromosoma artificial de levadura que incluía la región crítica de la enfermedad. Tras un estudio posterior de Northern Blots y RT-PCR se estudió la expresión de los genes en queratinocitos y se encontraron defectos en ATP2A2 (o SERCA2, una ATPAsa Ca2+ lenta del retículo sarcoplásmico del músculo estriado)222.

RFLP. Análisis de fragmentos de restricción mutación, mediados por iniciadores o no

El RFLP (restriction fragment lenghth polymorphism) utiliza enzimas (endonucleasas) de restricción que rompen el ADN en determinadas secuencias, de existir una mutación en estas secuencias no se produciría la rotura y el número de fragmentos observado en electroforesis será menor que de no existir la mutación. Existe una modificación en la técnica en la que, en el caso de que el fragmento que queremos detectar mutaciones no haya ninguna secuencia susceptible de reconocimiento por ninguna enzima de restricción, se introduce la secuencia sensible a la rotura por el enzima de restricción en el iniciador de la PCR de forma que esta secuencia que de justo en la vecindad de los posibles sitios de las mutaciones que buscamos. Como resultado de la sustitución de bases, de existir esta mutación, el sitio de restricción es irreconocible por el enzima.

Cuando las sondas son probablemente dirigidas contra un gen o una región cercana a éste, que puede ser desconocido, pero se cree que se asocia con una determinada enfermedad o locus, se habla de análisis indirecto, análisis de relación o linkage analysis. Un alelo se define como "relacionado" a un gen causante de una enfermedad si se encuentra en individuos afectados con una frecuencia mayor que la esperada por el azar La asociación de una enfermedad con un haplotipo genético relacionado se denomina desequilibrio de relación (linkage dysequilibrium)223.

Los estudios de análisis de relación han sido esenciales en el estudio de enfermedades hereditarias, aunque sólo pueden ser utilizados cuando existe polimorfismo en un determinado locus. Otro requisito es que debe existir una familia con varios sujetos afectados, y todos deben participar en el estudio. Por otra parte, otra limitación es que no todas las familias afectadas ofrecerán datos relevantes para un determinado marcador polimórfico relacionado223. Por ello, el diagnóstico molecular está evolucionando hacia otras técnicas que permiten la detección directa pues los genes específicos están siendo clonados y caracterizados y se están identificando las mutaciones correspondientes.

Una ventaja de esta técnica es que, si se conoce la localización cromosómica del gen marcador, puede establecerse la localización cromosómica del lugar polimórfico (por tanto del gen mutante con él relacionado). De esta forma ha sido posible localizar el gen de la fibrosis quística en el cromosoma 7, lo que en último término ha permitido su clonación. La lista de enfermedades de un solo gen en el que el análisis de relación es útil continúa creciendo y entre ellas se encuentran la distrofia muscular de Duchenne, el síndrome del cromosoma Xfrágil, la enfermedad poiiquística renal y la neurofibromatosis224.


Aplicación en dermatología

Esta técnica se ha empleado en el diagnóstico de la anemia de células falciformes, pues en el gen normal de la beta-globina (HbA) existen tres lugares que son reconocidos específicamente por la enzima de restricción Mst II225.

En la detección de portadores y en el diagnóstico prenatal de enfermedades con importante heterogeneidad en sus mutaciones, como la hemofilia A y B, cuyos genes, además son de gran tamaño, lo que impide un examen rápido de todos sus exones, se utiliza linkage analysis indirecto con RFLPs, lo que hace necesario disponer de numerosos miembros de la familia226.

En la atriquia universal congénita o atriquia con lesiones papulosas (una forma hereditaria de alopecia, en el que la pérdida de pelo ocurre poco después del nacimiento y años después se sigue una erupción papulosa difusa) el análisis de relación usando marcadores microsatélites de la región del gen de la pérdida de pelo (hairless) humano demuestra que el locus de la atriquia con lesiones ampulosas se encuentra en la región cromosómica 8p 12227,228. En esa misma región se ha detectado el gen responsable de la hipotricosis de Marie Unna, un trastorno autosómico dominante que aparece en la infancia229. Existen otras formas hereditarias de alopecia que no están relacionadas con el gen de la pérdida de pelo humano del cromosoma 8230.

En la porfiria cutánea tarda esporádica se ha estudiado la mutación de un gen similar a MHC clase I cuya mutación se piensa que es la causa de la hemocromatosis. Con la digestión por enzimas de restricción de ADN genómico amplificado por PCR es posible detectar esta mutación en donantes de sangre sanos. La mutación Cys282Ty aparece en un 44% de los pacientes y un 11% de los controles, por lo que son necesarios estudios posteriores sobre esta enfermedad231.

En la dermatitis atápica, el estudio mediante PCR-RFLP en sangre periférica muestra un predominio significativo (85%) de homocigotos para alelos acetiladores lentos (N-acetiltransferasa 2, NAT2) entre los pacientes con dermatitis atópica, frente a un 54% en sujetos sanos232. otros estudios describen una mayor frecuencia de acetiladores rápidos en pacientes con dermatitis alérgica de contacto que en controles233.

El estudio W polimoffismo alélico del gen quimasa de mastocitos (MCC, una proteasa sérica segregada por los mastocitos) indica que las variantes genéticas del gen MCC se asocian sobre todo al eccema atópico solitario, con IgE sérica inferior a 500 IU/mL, y no se asocian sobre todo al eccema atópico con enfermedad respiratoria y una IgE sérica superior a > 2000 IU/mL234.

En familias japonesas se ha observado que las diferencias en la actividad transcripcional del gen de IL4 influye en la predisposición a dermatitis atópica, al estudiar el polimorfismo del gen 
IL4235. En otros estudios, usando marcadores muy polimórficos, se observa vínculos entre la dermatitis atópica y marcadores del cromosoma 11q13 (como D11S903 y el gen del receptor IgE de gran afinidad {FCER 1 B ó Fc(epsilon) RI-b Leu 181}236,237.

Las técnicas genéticas son útiles para explicar cómo los defectos en la angiogénesis participan en ciertas anomalías vasculares. Las mutaciones en genes de los receptores del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGFR-w y VEGFR-2) y los defectos en el gen responsable de la producción deVEGF son letales para el embrión en desarrollo por causar errores en la diferenciación endotelial normal y en la formación de vasos238. Por otra parte, las mutaciones de los genes de los receptores de la tirosinquinasa Tie-1 y Tie-2 se asocian a malformaciones hereditarias venosas en varias familias238.

La telangiectasia hemorrágica hereditaria o síndrome de Rendu-Osler-Weber es una anomalía vascular sistémica autosómica dominante, causada por mutaciones en genes de algunas proteínas expresadas por las célula endoteliales (proteínas de unión al factor del crecimiento transformante beta, endoglina y quinasa similar al receptor de activina)238 .

En la cavernomatosis familiar cerebral asociada a angiomas cutáneos, un trastorno autosómico dominante, se ha identificado el gen causante en el cromosoma 7q, mientras que el gen del síndrome de malformación vascular autosómico dominante en el que las lesiones predominantes son cutáneas, se ha mapeado en el cromosoma 9p21239 . En el síndrome de Bean o de nevus vejiga de caucho azul, caracterizado por múltiples hemangiomas azulados de la piel y el tracto gastrointestinal, el gen se ha identificado en el cromosoma 9p240. En otras familias con hemangiomas infantiles, que también se heredan de forma autosómica dominante con alta penetrancia, el análisis de relación localiza el gen en el cromosoma 5q241.

El gen de la neurofibromatosis tipo I se localiza en el cromosoma 17 y el gen del tipo II se ha situado en el cromosoma 22. En el síndrome von Hippel-Lindau el gen se ha localizado en el cromosoma 3p25-26242.

En estudios genealógicos, el locus responsable del síndrome de Marfan ha sido localizado en el cromosoma 15q21.I, que codifica la fibrilina 0. Las mutaciones en la fibrilina 2 originan la aracnodactilia crontractural congénita, las fibrilinas son microfibrillas que solas, o en combinación con la elastina confieren las propiedades biomecánicas al tejido conjuntivo. Dada la heterogeneidad del gen de la fibrilina I, el diagnóstico prenatal y presintomático del síndrome de Marfan que es posible mediante RT-PCR, está limitado a unas pocas familias243.


Técnicas estructurales

-DGGE/TGGE Electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes /Electroforesis en gel con gradiente de temperatura

La DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis)/ TGGE (temperature gradient gel electrophoresis) es el método más eficaz y utilizado. Se realiza una electroforesis del ADN de doble cadena a través en gel con concentraciones crecientes de un agente desnaturalizante (urea o formamida) o en el que la temperatura es creciente. Así, el ADN de doble cadena se disocia dependiendo de su conformación a una temperatura o una concentración de desnaturalizante diferente dependiendo de la existencia o no de mutaciones. Esto hace que, de existir una mutación en el fragmento de ADN estudiado previamente amplificado por PCR, habrá bandas diferentes a las que aparecen en la electroforesis de ese mismo fragmento de ADN estudiado previamente amplificado por PCR, habrá bandas diferentes a las que aparecen en la electroforesis de ese mismo fragmento de ADN normal. Este método permite separar segmentos de ADN de menos de 1 kb de longitud que contienen una única mutación244.

Una variante de esta técnica es la electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes constantes (CDGR), en la que la concentración del agente desnaturalizador químico sea constante y cercana a la que separa las cadenas del fragmento normal215

Los inconvenientes de esta técnica es que sólo permiten detectar fragmentos de ADN de hasta 600 bp, requiere un equipo sofisticado y las condiciones exactas del gen a menudo han de ser determinadas para cada fragmento examinado. La limitación en el tamaño del fragmento de ADN puede evitarse utilizando electroforesis bidimensional, en la que la separación por tamaño de fragmentos ocurre en la primera dimensión bajo condiciones del gel constantes y la separación por secuencia ocurre en la segunda dimensión mediante DGGE215.

Algunos genes son resistentes al método DGGE debido a su alto contenido en nucleótidos G+C. En estos casos puede utilizarse SSCP que es fácil de realizar. aunque debe definirse cuidadosamente las condiciones de trabajo245.

Aplicación en dermatología

Mediante PCR con iniciadores específicos para segmentos Vgamma 1-8 y Vgamma9 del gen del receptor de linfocitos T (TCR-gamma), en combinación con electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes (PCR-DGGE), se ha observado que un 66% de micosis fungoides en estado en placa y un 100% de micosis fungoides en estadio tumor o de linfomas cutáneos de células T pleomórficos presentan reordenamientos clonales del gen TCR-gamma, mientras ninguno de los pseudolinfomas cutáneos de células T, estudiados presentaban este reordenamiento246.
En los estudios comparativos entre las diversas técnicas de electroforesis para la demostración de poblaciones clonales de células T en biopsias de piel y su diagnóstico diferencial con dermatosis inflamatorias, la electroforesis en gel con gradiente de temperatura cargada con heterodúplex (HD-TGGE) y el análisis de fragmentos son más sensibles que la electroforesis en gel de poliacrilamida cargada con heterodúplex en geles MDE (mutation detection enhancement). Por su coste, la más recomendable es HD-TGGE247.

-SSCP Polimorfismo estructural de cadena simple

Bajo ciertas condiciones, los ácidos nucleicos monocatenarios adoptan estructuras tridimensionales secundarias en solución. Estas estructuras varían dependiendo de la composición de las bases y pueden resultar alteradas por el cambio de una única base. Esto hace que, si existe mutación en el ADN estudiado, la estructura tridimensional que adopta éste sea diferente de la que adopta el ADN normal de control, por lo que las bandas obtenidas en la electroforesis de ambos productos serán diferentes debido a que la agarosa (o poliacrilamida) ofrecerá distinta resistencia al paso del ADN dependiendo de su estructura tridimensional (bajo condiciones no desnaturalizantes215.

SSCP (single-strand conformation polymorfism) es una técnica relativamente simple que se utiliza en el cribado inicial de mutaciones. Si se observa una banda anormal, ésta puede ser extraída del gel y, posteriormente, secuenciada directamente los productos amplificados mediante PCRIII. Permite analizar fragmentos de ADN de hasta 250-300 bp y con múltiples geles, permite detectar hasta el 95% de las mutaciones215.

Aplicación en dermatología

Se utiliza para detectar mutaciones en toda la región de codificación del gen p53. Las mutaciones de p53, estudiadas con PCR-SSCP se encuentran más frecuentemente en carcinomas epidermoides infiltrantes que en el carcinoma in situ (enfermedad de Bowen) o microinfiltrante126. También se asocian a linfomas cutáneos primarios y a la evolución de micosis fungoides estadio placa a estadio tumoral143 y a la transformación histológica del linfoma folicular en un linfoma difuso más agresivo249. Sin embargo, tanto SSCP como el análisis de secuenciación de ADN puede dar lugar a falsos negativos debido a la presencia de células del estroma o células normales residuales en la biopsia, aunque en el examen microscopico preliminar predomine la presencia de células tumorales. Por otra parte, SSCP permite detectar mutaciones puntuales en fragmentos que no son mayores de 300 bp250.

También se utiliza en el estudio de gen supresor tumoral hptc (patched), cuyas mutaciones se describen en el epitelioma basocelular y parecen ser más frecuentes en el epitelioma basocelular esporádico (30%) que en el asociado a xeroderma pigmentoso (11%). Además, se ha comprobado la coexistencia de mutaciones en p53 y en hptc en un 50% de los epiteliomas basocelulares asociados a xeroderma pigmentoso251.
Los estudios moleculares permiten asimismo estudiar el origen histogenético de algunas células. De esa forma, el descubrimiento de polimorfismo de la molécula CDla en célula de Langerhans de donantes en los receptores de trasplante de médula ósea, parece indicar un origen en médula ósea de este tipo celular. Que a su vez podría representar un dendrocito inmaduro. Otra prueba de dicho origen es la presencia de cromosomas Y en las células de Langerhans en mujeres trasplantadas con la médula ósea de donantes varones252.

- Análisis de heterodúplex

Se somete una mezcla de ADN control y de ADN a estudio a desNatluralización por calor y a reacoplamiento (reannealing) posterior Si no existe mutación sólo se producen homodúplex (cadenas que emparejan todos sus nucleótidos) pero si existe la mutación se producen tanto homodúplex como heterodúplex (cadenas que no emparejan 100% puesto que algunos de sus nucleótidos son distintos). Los homodúplex y los heterodúplex tendrán distintas movilidades electroforéticas. Así, de existir la mutación aparecerán dos bandas y de no existir sólo una(253).
Se realiza en geles no desNatluralizantes y tiene la ventaja de no necesitar controlar las condiciones del análisis para cada fragmento de ADN. Por otro lado, el método HET detecta un número menor de mutaciones que DGGE y suele utilizar junto con otros métodos215.

Aplicación en dermatología

El cribado molecular de algunos genes, como el colágeno VII (COL7AI) en pacientes y familiares puede realizarse mediante análisis de heterodúplex, que permite detectar mas del 90% de las mutaciones de este gen. Este gen se encuentra alterado en la epidermólisis ampollosa distrófica, pero no se identifica mutaciones en el síndrome de Kindler un raro trastorno caracterizado por ampolla acrales en la infancia temprana y poliquilodermia generalizada con marcada atrofia cutánea y en el que se desconoce el lugar exacto de la dehiscencia253.
El gen de la laminina 5 se ha mapeado en el cromosoma 8. Su expresión está muy reducida en la epidermólisis ampollosa juntural grave de Herlitz y generalmente se detecta en la epidermólisis ampollosa juntural no let al254.

-Electroforesis con concentraciones de disolventes parcialmente desNatluralizantes

Esta técnica es poco utilizada y permite detectar mutaciones en fragmentos de hasta 800 bp2l5.

Métodos basados en los errores de acoplamiento

-Método de la rotura por ARNasas

Bajo determiNatllas condiciones los puntos donde hay errores en el acoplamiento (mismatches) entre heterodúplexARN:ARN yARN:ADN pueden ser rotos por una ARNasa. Tras la rotura los fragmentos se analizan por electroforesis con desNatluralización en gel255. Pero este método sólo detecta un 50% de las mutaciones215.

-Método de la rotura química. CCM (chemical cleavage method)

Los nucleótidos desemparejados en los heterodúplex ADN:ADN o ADN:ARN son modificados por agentes químicos (hidroxilamina y tetróxido de osmio son peligrosos y se han sustituido por carbodiimida) que no afectan a los nucleótidos emparejados. Luego los heterodúplex son expuestos a piperidina que los rompe en los sitios donde hay modificación química256. La localización de la mutación puede deducirse del tamaño de los fragmentos obtenidos. Esta técnica puede detectar mutaciones en fragmentos de ADN de hasta 1499 bp de longitud, con un 90 a 95% de eficiencia215.

-Método de la rotura enzimática. EMC (enzyme mismatch cleavage)

Se produce los heterodúplex ADN:ADN por calor y reacoplamiento y se exponen a una endonucleasa tras lo cual los fragmentos se analizan por electroforesis en gel. Se ha utilizado las nucleasas de la haba mung y S1, pero este método es muy dependiente de la secuencia y no detecta muchas mutaciones215.

-EMC con resolvasas de bacteriófagos

Es un método sensible para la detección de mutaciones en heterodúlplexs de ADN ramificadas. Dos de estas enzimas, la T4 endonucleasa VII (T4E7) y la T7 endonucleasa I, (T7E1) rompen en ADN cerca de los sitios de discordancia de las bases. Los productos de la rotura pueden ser analizados mediante electroforesis en gel y permite analizar fragmentos de al menos 1500 bp. el método permite detectar un 95% de las mutaciones y parece ser más sensible que SSCP en el cribado de algunos genes, como BRCA1215.

-CFLP (cleavage fragment lenght polymorphism) Polimorfismo de longitud de fragmentos de rotura

Tras desNatluralizar los fragmentos de ADN de cadena simple éstos se doblan sobre sí mismos formando unas estructuras tridimensionales secundarias que dependen de su secuencia y que contienen numerosos pliegues y horquillas. La endonucleasa "cleavage" I rompe el ADN en los puntos en los que comienzan esas horquillas, en el punto 5 de la unión entre el ADN de cadena simple y el de doble cadena. Por lo tanto, este enzima produce fragmentos que serán distintos en el segmento de ADN normal de control y en el ADN problema de existir en éste un cambio en la secuencia (inserciones, deleciones o mutaciones puntuales215.

-Detección de mutaciones por proteínas que se unen a los errores de acoplamiento (mismatch binding protein)

Se generan heterodúplex por calor y posterior reacoplamiento entre cadenas de ADN control normal y ADN mutado. Después se incuban con proteína MutS (que forma parte del sistema de reparación de ADN de la E. coli). Esta proteína queda unida a los puntos donde no hay acoplamiento entre los nucleótidos enfrentados. Después somete esa mezcla a la acción de exonucleasas, como la MutS protege al ADN al que está unida de la rotura por exonucleasas, el número y tamaño de los fragmentos obtenidos tras esta digestión será diferente de no haber mutación (en cuyo caso tendríamos homodúplex a los que no se habría unido proteína) que de haber mutación (en ese caso la proteína protegería algunos puntos en los que, sin ella, podría haber actuado la exonucleasa obteniéndose menos fragmentos). Una variación consiste en que la proteína se inmoviliza en membranas de nitrocelulosa; esto hace que aumente significativamente la afinidad de la proteína por el ADN no acoplado, lo que permite detectar un mayor número de mutaciones y evaluar fragmentos de mayor tamaño. Además, al detectarse las notaciones mediante unión en vez de mediante separación de fragmentos en electroforesis en gel, esta técnica podría automatizarse215.

También se ha utilizado la transfección del heterodúplex de ADN a E. coli in vivo. Es una técnica compleja que permite analizar una secuencia amplia (hasta 10 kb) de ADN215

-PTT Test de truncamiento de proteínas

El PTT (protein truncation test) sólo sirve para detectar mutaciones que implican la aparición de un codón (secuencia de 3 nucleótidos) de fin de la traducción proteica (stop codon). Se realiza una PCR para amplificación de un gen que codifica para una determiNatlla proteína utilizando iniciadores a los que se ha añadido secuencias de iniciación para células eucariotas y un promotor T7. Por lo tanto, los productos de PCR (que contienen estas secuencias) se pueden someter a reacciones de transcripción-traducción con lo que se consigue péptidos. El tamaño de los péptidos será menor en el caso de que ADN contenga una mutación que determine la aparición de un codón de fin puesto que la reacción se detendrá en este punto. El tamaño de los péptidos se determina mediante electroforesis de los mismos para proteínas (Western blot)215.

- ASO (Allele-specific oligonucleotide hibridation oNatllNchips)

El ASO (Allele-specific oligonucleotide hibridation on ADN chips) consiste en fijar sondas de oligonucleótidos de secuencia conocida a una base sólida (chip) y exponer esta base a las secuencias diana marcadas para detectar si se unen a los oligonucleótidos (son complementarios) o no. Hay que diseñar un chip especial con los oligonucleótidos específicos para la secuencia que queremos buscar y para el cribado de cada nucleátido dada una secuencia consenso requiere la exposición a cuatro sondas distintas. Si el número de posibles alelos es muy elevado, puede utilizarse dot-blotting inverso. En este caso, el panel de sondas de oligonucleótidos es inmovilizado en el filtro y se hibrida con un producto de PCR marcado. Entre las aplicaciones de esta técnica inversa se encuentran las pruebas de HLA y forensía, y el diagnóstico de la beta-talasemia y de la fibrosis quística, en las que pueden existir múltiples mutaciones257.

ASO, sobre todo mediante dot-blotting inverso258, y el PCR-SSP (sequence-specific priming)259 se realiza para el cribado inicial de posibles donantes y son considerados métodos con una relativa baja resolución en la tipificación de HLA. Gracias a estas técnicas es posible identificar un posible donante con pelos enviado por correo. Como método de alta resolución, para seleccionar el donante más adecuado, se utiliza PCR-RFLP

MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE MUTACIONES CONOCIDAS (DIAGNÓSTICO DIRECTO DEL GEN).

La secuenciación de ADN no es un procedimiento definitivo para la detección de mutaciones, pero es muy laboriosa. Por ello, se ha desarrollado técnicas más eficientes, aunque no están aún totalmente automatizadas y requieren un instrumental costoso. Por otra parte, muchas de estas técnicas no ofrecen información sobre la localización o la Natluraleza de la mutación dentro de un fragmento de ADN determiNatllo. Este último inconveniente puede ser soslayado con los métodos en los que los heterodúplexs de ADN son cortados en la posición de los nuecleótidos no concordantesl 11.

ASO. Hibridación con oligonucleótidos específicos de alelo

El ASO (Allele-specific oligonucleotide hibridation) se emplea cuando la mutación que produce la enfermedad no altera los lugares de corte de ninguna enzima de restricción conocida. Se transfiere el ADN producto de LCR (o de reacción en cadena de ligasa), cortado en fragmentos y sometido a electroforesis desde un gel a una membrana de nylon donde se inmoviliza, o bien se fija el producto de PCR directamente a una membrana (dot-blot). Después se procede a hibridar estas membranas con oligonucleótidos complementarios a la secuencia Natliva a una temperatura determiNatlla. De existir una mutación en el punto que buscarnos no se producirá la hibridación260.


Aplicación en dermatología

También se ha utilizado esta técnica en el diagnóstico de hemogloblinopatías como la anemia de células falciformes261, aunque uno de los ejemplos más demostrativos es la deficiencia de alfa 1 -antitripsina, que a menudo se asocia a un solo cambio G-> A en el gen de la alfa 1 -antitripsina, produciendo el alelo Z262.

Utilizando oligonucleótidos específicos de secuencia y ADN genómico amplificado para los alelos HLA-DQA1, DQB1, y DPB1, se ha observado una frecuencia elevada de DQB1 *03 y una frecuencia disminuida de DQB1 *06 en los pacientes de alopecía areata263.

-Amplificación específica de alelos ASA (Allele-specific amplification)

Se realiza dos PCR paralelas: una de ellas utilizando como iniciador 5' una secuencia complementaria a la secuencia normal y la otra utilizando como iniciador 5' una secuencia complementaria a la secuencia mutada que queremos detectar Si existe la mutación se producirá amplificación sólo en el tubo que contiene el iniciador de la secuencia mutada mientras que el iniciador de la secuencia normal no se habrá unido al ADN de muestra y por lo tanto no habrá amplificación y viceversa215.

-Extensión del iniciador de un solo nucleótido. (Single nucleotide primer extension) Minisecuenciación

Su principio es similar al del ASA. Se basa en la extensión del extremo 3'del iniciador por un único nucleótido marcado. La adición de este nucleótido (extensión) ocurre cuando el nucleótido marcado es complementario al nucleótido adyacente al extremo 3' del iniciador en el ADN muestra. Así, si hay mutación no se une el nucleótido y no se detecta el marcaje215.

-ARMS. Sistema de mutación refractario a amplificación

Se utiliza dos cebadores idénticos en su secuencia excepto en su nucleótido 3'. Uno tiene el nucleótido 3' complementario al gen salvaje, mientras que el otro cebador 3' es complementario al gen mutado. La amplificación sólo ocurra con emparejamientos perfectos, con lo que dependiendo de qué cebador origine una señal positiva, podremos distinguir el gen salvaje del gen mutado264 , ARMS es un método especialmente sensible para la detección de mutaciones.

-OLA (oligonucleotide ligationassay) Prueba del enlace de oligonucleótidos o LCR (ligase chain reaction) Reacción en cadena de la ligasa

Se utiliza dos pares de iniciadores, complementarios a lugares donde puede haber mutaciones o polimorfismos en el ADN a estudio de modo que estos iniciadores se acoplen con el ADN de forma que queden consecutivos

(es decir que el extremo 3' del primero se continúe con el extremo 5' del segundo). Cuando no hay mutación los iniciadores se colocan consecutivos y se pueden ligar por la acción de una ligasa tras lo cual es posible amplificar el ADN con PCR, pero si hay mutación los fragmentos no se acoplan 100% al ADN muestra y no están consecutivos, por lo tanto la ligasa no puede unirlos con lo que tampoco es posible la amplificación correcta con la PCR265.

Aplicación en dermatología

Junto con la PCR, se ha utilizado para el estudio de mutaciones del gen p53 en la carcinogénesis por rayos ultravioleta, observándose que en la piel normal expuesta a esta radiación pueden identificarse mutaciones del gen p53, sobre todo en los codones 245 y 247/248266.

INESTABILIDAD DE MICROSATÉLITES

Utilizando distintas técnicas no se estudia la presencia o ausencia de mutaciones puntuales o polimorfismos génicos sino la situación de un genoma anómalo (por ejemplo de un tumor) comparándola con la situación del genoma normal. Lo que se compara entre ambos genomas son unas secuencias relativamente conservadas, que aparecen en 10,0090 o 100,000 locus en cada genoteca y que se encuentran constituidas por una repetición sistemática de entre 1 y 6 pares de bases aproximadamente unas 100 veces, estas secuencias se denominan microsatélites. Se estudia al menos 5 microsatélites distintos comparando el genoma tumoral con el normal. Si se encuentran variaciones en la migración de las bandas en electroforesis (es decir diferencias en el tamaño) entre el genoma tumoral y el normal en al menos dos microsatélites se considera que existe una inestabilidad génica en el tumor Esta situación se ha estudiado con relativa frecuencia en carcinomas de colon y también se detecta en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica, fibrosis quística, neurofibromatosis, distrofia miotónica, síndrome de Charcot-Marie-Toth, síndrome de Kaliman o síndrome del cromosoma X frágil267.

Las ventajas del análisis de microsatélites son utilizar muy poca cantidad de ADN, tener una resolución alta, ser muy reproducible, existir un gran número de sitios bien localizados y muy informativos, ser más sencilla que la técnica de Southern, y permitir el marcaje con métodos radioactivos o no radioactivos25. Sin embargo, también tiene algunos inconvenientes, como la necesidad de realizar muchas reacciones para distinguir entre pérdidas y ganancias alélicas y examinar solamente una porción muy pequeña del genoma25.


La pérdida de heterocigosidad (LOH) o pérdida de uno de los alelos en una región en particular es habitualmente detectada por Southern blot o por análisis de microsatélites25. La LOH es útil para identificar alteraciones en regiones cromosómicas grandes y para delimitar las regiones de interés en cromosomas determiNatllos, sin embargo, no es un método válido para la identificación de nuevos genes supresores25.

Aplicación en dermatología

Aunque se ha detectado la presencia de trisomía 7 en algunos estudios de queratoacantoma y carcinoma epidermoide de piel76, en el queratoacantoma esporádico sólo se identifica inestabilidad microsatélite en el locus 17p 12 (D17S520, p53) en un 10% de los tumores estudiados y no se identifica pérdida de heterocigosidad, por lo que los eventos genéticos parecen jugar un papel secundario en la génesis del tumor119,268,269,270.

En el síndrome Muir-Torre el análisis de microsatélites de queratoacantoma, adenomas sebáceos, epiteliomas basocelulares y adenocarcinoma metastásico en la piel en estos enfermos, muestran una marcada inestabilidad microsatélite271 . Estos pacientes podrían compartir mecanismos genéticos de génesis tumoral con los pacientes con carcinoma colorrectal hereditario no asociado a poliposis273.

La pérdida de heterocigosidad en el cromosoma 9q22,3 y las alteraciones en genes supresores ubicados en esa región parece ser un evento tardío en desarrollo del carcinoma epidermoide de piel y no se identifica en la piel normal expuesta que presenta mutaciones del gen p53, ni en las displasias, mientras que aparece en el 65% de los carcinomas in situ y carcinomas epidermoides de piel273.

El análisis de microsatélites y la pérdida de heterocigosidad en más de un brazo cromosómico no sucede en el liquen plano oral, ni en las lesiones reactivas de la boca, y sí son frecuentes y gradualmente crecientes en las displasias epiteliales y en el carcinomas epidermoide274 .

La pérdida de heterocigosidad en los cromosomas 6q y 10q en el melanoma cutáneo se asocia a un peor pronóstico clínico275.

La porfiria cutánea tarda esporádica es una enfermedad cutánea que se asocia a siderosis hepática. Los alelos microsatélites que definen el haplotipo hemocromatosis ancestral (HLA-A3) se estudia en estos pacientes231.

La ictiosis congénita autosómica recesiva es un trastorno de la queratinización clínicamente heterogéneo. En los subtipos ictiosis lamelar y eritrodermia ictiosiforme congénita no ampollosa se describe mutaciones en el gen de la transglutaminasa 1. Los marcadores de microsatélite relacioNatllos con este gen permiten el estudio de familias con estas enfermedades276.

La psoriasis es una dermatitis crónica inflamatoria que afecta a un 2% de la población. Mediante linkage analysis, se ha mapeado varios genes de susceptibilidad posibles, sobre todo en las regiones cromosómicas 17q y 6p, pero también en 2p, 4q, 8q, l6qy 20p. Los estudios mediante microsatélites no han podido demostrar un vínculo significativo con esos marcadores y sí con marcadores para el cromosoma 1 cen-q21 (la molécula CD1d es codificada en esta región)277. Mediante marcadores microsatélites polimórficos se ha localizado el gen de psoriasis vulgar en un segmento de 111 kb telomérico al gen HLA-C278. La mayoría de las investigaciones se centran la región MHC clase 1, en el cromosoma 6, sobre todo en el alelo HLQ-Cw6279.


ACTIVIDAD DE TELOMERASA

La capacidad de crecimiento ilimitado de las células neoplásicas requiere la actividad de la ribonucleoproteína telomerasa280,281,282. Sin esta enzima, los extremos de los cromosomas(telómeros) se van acortando en cada división mitótica. Cuando los telómeros están agotados, la célula deja de proliferar y comienza su senescencia. Las células malignas contienen actividad de telomerasa para estabilizar sus telómeros50.

El oncogén c-myc induce telomerasa tanto células epiteliales283. La expresión de telomerasa puede ser detectada por varios métodos:

Protocolo de amplificación de repetición telomérica (TRAP) 

Se emplea para determinar la actividad de telomerasa282. El resultado puede expresarse en unidades relativas respecto al control positivo (100 unidades) y el negativo (0 unidades).

RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa-transcripción inversa)

Se utiliza para detectar el molde del ARN de telomerasa (hTR) en extractos de tejidos

Hibridación in sítu

Se aplica para localizar en hTR en cada célula, lo cual es necesario en tumores como la enfermedad de Hodgkin en la que las células de Reed-Sternberg apenas constituyen un 1 % de la masa celular total50.

Se ha comprobado, sin embargo, que las células linfoides normales pueden expresar telomerasa, por lo que los extractos de tejidos no son útiles para la determinación de la presencia de esta molécula en procesos linfoproliferativos50.
La actividad de telomerasa se detecta en 30% de úlceras cutáneas crónicas por radiación y puede ser un marcador para predecir el pronóstico y el efecto del tratamiento de estas úlceras284.
La Tabla 8 refleja un resumen de las aplicaciones prácticas de algunas de las técnicas aquí estudiadas.

CONCLUSIONES

La existencia de técnicas moleculares más sencillas y el mejor conocimiento de los mecanismos genéticos de las enfermedades, a lo que sin duda ha contribuido la libre disponibilidad de bases de datos de bibliografía médica y de mutaciones, como OMIM285 o Human Genome Organization (HOGO) Mutation Database Initiative286 han permitido popularizar el empleo de estos nuevos métodos en el diagnostico dermatológico.

En un futuro próximo, estarán disponibles de forma rutinaria nuevas técnicas aplicables a dermatología que permitirán un mejor análisis de los productos de KR, como la cromatografía líquida de alto rendimiento, la electroforesis capilar o la PCR, la electroforesis capilar o la KR sobre chips de oligonucleótidos22. Los chips de oligonucleótidos para PCR son dispositivos fabricados mediante litografía fotográfica sobre chips de silicona, que contienen miles de oligonucleótidos diferentes unidos a la fase sólida. Las mezclas de complejos de ácidos nucleicos pueden ser analizados mediante hibridación del chip, y los pocillos positivos indican la presencia de una secuencia complementaria en la mezcla287.

También se extenderá el uso de nuevas técnicas de amplificación de ácidos nucleicos que competirán con PCR, como la amplificación de ácidos nucleicos basada en secuenciación (NASBA) o la replicación automantenida de secuencia (3SR). En ambos casos la tecnología se basa en la amplificación isotérmica de un ARN diana gracias a la actividad simultánea de transcriptasa inversa, ARN polimerasa y ARNsaH, que permite obtener ARN de cadena simple amplificado. Estas técnicas ya se han ensayado en la detección de HPV VIH-1 y citomegalovirus288.

En aquellas lesiones en la que sea importante valorar la morfología, las técnicas de hibridación in situ yPCR in situ serán el complemento lógico de la inmunohistoquímica. La hibridación in situ, con los nuevos métodos de amplificación de señal y microscopia confocal, se convertirá en una herramienta de rutina para la detección de determiNatllos ácidos nucleicos en los tejidos.

La citogenética seguirán siendo un complemento más de la morfología y de la biología molecular, no sólo a través de la hibridación in situ sino con la realización de estudios con sondas que marcan las diversas regiones del cromosoma con diferentes colores (Figura 3).

En todo caso, será necesaria una estandarización en las técnicas de biología molecular y en su interpretación, para poder utilizar ampliamente estas herramientas con resultados válidos. Estos pasos serán facilitados principalmente FIGURA3

por la evolución tecnológica (Figura 4), la automatización en todos los pasos289 y la informatización de los datos obtenidos, incluyendo programas de control de calidad. Un ejemplo de esta evolución lo tenemos en el analizador avanzado de ácidos nucleicos (AAAN), que consiste en un dispositivo con diez módulos de reacción y una computadora portátil. En la pantalla van apareciendo las reacciones efectuadas en cada cámara, indicando número de ciclos, tiempo y estado de la detección289.
FIGURA 4

 

En los sistemas de PCR basados en fluorescencia, aún no disponemos de sistemas que permitan cuantificar cómodamente la cantidad de ADN monoclonal, por ejemplo del receptor de linfocitos T TCR-gamma, aunque se utiliza métodos semicuantitativos. El desarrollo de PCR cuantitativa o semicuantitativa permitiría monitorizar la respuesta A tratamiento de los tumores y comprobar la existencia de enfermedad residual mínima, por ejemplo en el síndrome de Sézary16.

Las investigaciones de clonalidad en los infiltrados linfocitarios de la piel pueden beneficiarse de nuevos métodos de alta resolución, como el análisis automatizado de reordenamientos del gen TCR-beta utilizando iniciadores marcados fluorescentemente. Estos métodos permiten detectar poblaciones oligoclonales en infiltrados de células T que antes eran considerados policlonales, como los pesudolinfomas cutáneos CD8 que aparecen en pacientes infectados por VIH207.

No hay duda que la clonalidad estudiada mediante PCR puede ayudar a los dermatólogos en el diagnóstico de malignidad linfoide cutánea temprana, sobre todo linfomas T cutáneos, siempre y cuando los resultados se analicen teniendo en mente todas las limitaciones que estos métodos poseen.

En muchas enfermedades en las que existe un mayor riesgo relativo en familiares, como la dermatitis de contacto alérgica al níquel, cuya base genética se desconoce, aunque se sabe que el gen TAP2B (transportador asociado con el procesamiento antigénico) se asocia con un mayor riesgo de alergia al niquel290 será necesario conocer mejor estos mecanismos genéticos antes de poder identificar det alladamente el o los genes responsables291.
FOTO 

Actualmente, se utiliza en la práctica clínica citoquinas recombinantes, como el interferón y las interleuquinas, u hormonas recombinantes como la insulina y la hormona de crecimiento humana, para tratar pacientes con enfermedades neoplásicas, virales, inflamatorias y genéticas. Se está investigando métodos seguros para transferir los genes terapéuticos (como interleuquina10 en enfermedades por hipersensibilidad) más eficazmente a los queratinocitos y mantener la expresión de ese gen durante mucho tiempo, y de esta forma tratar no sólo enfermedades dermatológicas sino sistémicas, como la hemofilia B, que podría ser curada introduciendo el gen del factor IX humano en quratinocitos292.

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