ROL DE LABIOLOGIA MOLECULAR EN LA COMPRENSIÓN DE LA PATOLOGIA DERMATOLOGICA Y SU TRATAMIENTO

VALDIVIA L¹

 

Dr. Luis Valdivia. Médico Dermatólogía de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
Asesor en Dermatología del Hospital Central de  la Fuerza Aérea del Perú.

INTRODUCCIÓN

La investigación molecular tiene por objetivo verificar hipótesis fisio patológicas a través del estudio de la expresión de genes normales o mutados conocidos en piel normal o patológica; la investigación de mutaciones de genes (identificación de las alteraciones en su secuencia y su expresión) y sus consecuencias, realización de transfecciones de células cutáneas in vitro por transgenes normales o patológicos, o la introducción directa de un transgene en un zigote o huevo fecundado de un animal (ratón o batracio): animal transgénico.

Otras áreas de investigación están dirigidas a iniciar la terapia genética como son la identificación de regiones cromosómicas ligadas a patologías cutáneas para identificar los genes codificantes (genética inversa) o la identificación directa del gen codificante (genética directa). También es importante la búsqueda de secuencias génicas de agentes infecciosos en donde otros procedimientos microbiológicos o inmunológicos fracasan para su detección en un tejido.

La intención del presente trabajo de revisión es realizar una vista panorámica de las aplicaciones de los estudios de biología molecular en la comprensión de la patogenia de las enfermedades cutáneas, en el tratamiento de éstas y, por supuesto, los riesgos que presentan en el momento.

APLICACIÓN EN LA COMPRENSIÓN DE LA PATOLOGíA CUTANEA

En Las enfermedades bulosas adquiridas y congénitas

Los genes de los antígenos del pénfigo vulgar (PV) y del penfigoide buloso (P8) han sido clonados por el método de bancos de ADN, permitiendo el análisis de la proteína correspondiente al PV molécula próxima a las cadherinasl ;y dos antígenos. PB1 (próximo a la desmoplakina I) y PB2 (presentando homologías con las moléculas colagénicas y llamada recientemente colágeno VIII) para el PB2. La epidermólisis bulosa simple (EBS) ha sido atribuida a mutaciones de la queratina 5 (EBS de tipo Koebner) ó 14 (EBS de tipo CockayneWeber)3-6, elementos claves del citoesqueleto y de la cohesión de las células basales. Las epidermólisis bulosas distróficas dominantes y recesivas están claramente ligadas, al me

nos en parte, a mutaciones del gen del colágeno de tipoVII5,7

En fin, las investigaciones concernientes a las epidermólisis bulosas de unión están en curso; este grupo patológico está, probablemente en parte, debido a mutaciones de los genes codificantes para ciertos compuestos de la basal, como la niceina, isoforma de la laminina, formada de tres subunidades proteicas que pueden cada una ser sede de las mutaciones.

Rol en los trastornos de queratinización

En la psoriasis han sido puestas en evidencia modificaciones de ciertos genes en los queratinocitos, como una hiperexpresión inconstante de los protooncógenos Ki-ras (Northern blot)8 y una baja de la expresión de c-fos y c-jun (HIS)9. De otro lado una hiperexpresión importante del "Transforming growth factor" (TGF) ha sido demostrado (Northern blot) en los queratinocitos lesionales, correlacionado a la aparición de un fenotipo psoriático en el caso de ratones transgénicos por el gen del fenotipo TGF puesto bajo la dependencia de un promotor fuerte10. Por el contrario, ninguna modificación de este tipo ha sido hallada en los fibroblastos lesionales.

De otro lado, mutaciones de las queratinas K1 y K10 han sido demostradas en ciertos casos de eritrodermias ictiosiformes congénitas bulosas. Un sitio ha sido identificado sobre el cromosoma X para la ictiosis ligada al X (locus p22-3) pero ningún gen es sospechoso de manera precisa6.

En la investigación de tumores cutáneos

Es sin duda uno de los campos de predilección de la biología molecular, permitiendo en ciertos casos una visión precisa de los mecanismos íntimos de la carcinogenesis. Así, mutaciones de protooncógenos celulares han sido puestos en evidencia en los carcinomas cutáneos (por Southern blot, PCR- SSCP y secuenciaje) mutaciones que conducen a su hiperactividad (demostrado por Northern blot, HIS); en otros casos se trata de una "simple" amplificación de estos protooncógenos. Estas modificaciones interesan los c-myc, la familia c-ras, c-mos, c-raf, etc.11-13. Estos datos son correlacionados a la aparición de tumores cutáneos en el caso de ratones transgénicos para los genes c-ras y c-fos mutados y a la aparición de un fenotipo tumoral sobre líneas celulares inmortalizadas por c-ras mutadas y transfectadas por c-fos igualmente mutado, ilustrando La necesidad de la cooperación de varios protooncógenos en la carcinogénesis netamente cutáneal4. Las mutaciones del antioncógene P53, gen de actividad antiproliferativa, han sido también identificados en los carcinomas basocelulares y sobre todo en los epidermoides, mutaciones que llevan a una pérdida de actividad de la proteína, lo más frecuente es que estas mutaciones sean inducidas por rayos ultravioletas (UV) lo que refuerza el lazo epidemiológico muy conocido, como es La exposición UV-carcinoma en el sentido de una relación etiológica directa15.

En los melanomas malignos, las modificaciones de Los protooncogenes celulares, tales como c-myb y c-myc, han sido hallados, pudiendo llegar a terminar en su hiperexpresión de la aceleración de la proliferación celular16. De otro lado el factor básico de crecimiento de los fibroblastos se comporta como un factor de crecimiento para los melanocitos, según esto, dicho factor es homólogo de los productos de los protooncogenes int-2 y hst que podrían jugar un rol en la progresión tumoral17.

Los estudios sobre p53, que es un gen supresor de tumores18, situado en el brazo del cromosoma 17, están en curso, recientemente una mutación homozigote del gen NF1, considerado actualmente como un antioncógeno, ha sido identificado en un caso de melanoma18. La presencia de células melánicas tumorales circulantes (por ejemplo, luego de cirugía) puede ser detectada con una muy gran sensibilidad por PCR inversa, utilizando el ARNm de la tirosínasa, ARNm en principio específicamente presente en las células pigmentarias.

En los linfomas T epidermotropos, los estudios de protooncógenos y de p53 son por el momento poco concluyentes, en ciertos casos secuencias retrovirales próximas del virus HTLV han sido identificados relanzando el

debate etiológico 20,21. En fin, el análisis de recidivas y potencialmente de la enfermedad residual es actualmente posible gracias al empleo de preparados de PCR y de sondas específicas de reordenamiento correspondientes al clon tumoral, luego de secuenciaje de este reordenamiento22.

Ciertas genodermatosis asociadas a La aparición de tumores cutáneos múltiples, benignos o malignos, han sido ligadas a loci cromosómicos bien precisos mismo si el gen en causa no ha sido aún claramente identificado: nevomatosis basocelular (9q22,3-31)23, carcinomatosis múltiple de Ferguson-Smith (9q 22,3-31)24.

Alteraciones pigmentarias

La genética molecular ha permitido importantes descubrimientos en ciertas genodermatosis; mutaciones del protooncógeno celular c-kit que coda al receptor en actividad tirosinquinasa del factor de crecimiento mastocitario

(MCF) en el piebaldismo25, mutación del gen PAX-3 en el síndrome de Waardenburg26, identificaciones de diversas mutaciones del gen codante de la tirosinasa en albinismos oculocutáneos tirosinasa negativos27. implicaciones posibles del equivalente humano del gen murino "pallid" co

dificado por la pallidina, proteína de membrana en los síndromes de Hermansky Pudlack y de Chediak-Higashi28, del homólogo humano del gen murino "pick-eyed" sobre el albinismo oculocutáneo tirosinasa positivo y la

hipomelanosis de Ito29 y del gen codificador para la subunidad a de la proteína G del adenilatociclasa en el síndrome de Cune-Albright30. Las mutaciones del gen NFI situado sobre el locus 17 q 11-2 en la neurofibromatosis de von Recklinhausen o tipo I20,31 o el locus 22q 1 1-2 de laneurofibromatosis tipoII32.

En la comprensión de la atopia

Enfermedad definitivamente genética, su transmisión no es simple y hace uso probablemente de un mecanismo poligénico. Aún así una ligazón importante ha sido hallada entre el "terreno" atópico y el Locus 11q 13 que comprende netamente al gen codificador, una subunidad de receptor de alta afinidad por las IgE33, sin embargo, no podemos considerar este locus como si fuera de la dermatitis atópica.

En la psoriasis

En descripción reciente de un aumento de la supresión en los queratinocitos de TGFa (uno de los principios estimulantes del receptor al EGF) es una buena posibilidad de que la psoriasis está ligada a una anomalía primaria de este gen10, abriendo la posibilidad de la terapia genética en ella.

Sobre la investigación de los receptores de los retinoides y de la vitamina D

Un importante trabajo de biología molecular permitió en 1987 identificar a los receptores del ácido transrretinoico llamado RARs ("retinoic acid receptors"34 , ellos pertenecen a la superfamilia de receptores nucleares. Posteriormente se ha identificado otros receptores llamados RXR donde el ligante es el ácido 19-cisrretinoico35-38 . A falta de anticuerpos fiables disponibles, estos receptores sólo pueden ser estudiados por instrumentos de biología molecular y su expresión en La piel humana ha sido demostrada por Northern b1ot39 . El estudio espacial de esta expresión es aún poco precisa (resultados contradictorios, HIS difícil). La expresión de los receptores de La vitamina D3 ha sido estudiada por los mismos medios y están localizados sobre todo en la epidermis40,41. Ninguna mutación de estos genes ha sido demostrada en patología cutánea humana39

Inmunogenética

Existe un campo de investigación en la biología molecular que es La inmunogenética, dedicada al estudio de los genes del sistema HLA, de la investigación de alelos particularmente frecuentes. Interesa para La detección de patologías a veces familiares. Así La expresión de alelos DR4, DRB 1 y DRW6DQB1,3 está significativamente aumentado en el PV y el alelo DRB 1, en el caso de enfermos, difiere de su homólogo en el caso de sujetos sanos por 3 ácidos aminados42 . En las psoriasis familiares el grupo CW6 es particularmente expresado, luego del estudio más preciso del gen codificador para CW6: la presencia de RFLP (restriction fragments lenght polymorphism) ha sido detectado en estos pacientes43. Otras formas de expresión se ha visto en subgrupos de psoriáticos: HLA B13 (tres veces más frecuentes), B17 asociados a la forma severa, B37 y, sobre todo, CW644.

LA INVESTIGACIÓN EN BIOLOGÍA MOLECULAR Y SUS APLICACIONES EN El TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES DE LA PIEL

Las aplicaciones de los avances de biología molecular, en el tratamiento se conoce como Terapéutica genética, que se define como una transfección de material genético, siendo sus objetivos principales:

a. En primer lugar, La corrección de déficits genéticos por inserción de un gen normal dentro de un tejido donde es deficiente, Lo que puede hacerse de dos formas.

La primera, reemplazando directamente el gen anormal, en su lugar, dentro del genoma. Este método es realizado por Las técnicas de recombinación homóloga, de práctica muy delicada y no utilizables en el caso del hombre actualmente. Otra forma de corrección de un déficit genético se puede hacer insertando en el genoma una versión normal del gen defectuoso. Este tipo de estrategia está en estudio para el tratamiento de la inmunodeficiencia ligada al déficit en adenosinadeaminasa o de la mucovicidosis, debido a una anomalía del gen CFTR (cysticfibrosis transmembrane regulated)45.

b. Un segundo objetivo es asegurar la liberación de un producto biológico deficitario y que es origen de una enfermedad.

Esta liberación podría hacerse a partir de células que obligatoriamente no Lo producen en el estado normal, pero que son de acceso o manipulación genética fácil, como son los queratinocitos, los fibroblastos y las células endoteliales, Los que por ingeniería genética podrían producir los factores deficitarios. Este principio se aplica más particularmente al tratamiento de déficits en factores IX y VIII responsables de la hemofilia B y A, respectivamente46-48.

c. El tercer objetivo es el tratamiento de la patología tumoral y utiliza una serie de estrategias. Una de ellas, es hacer que ciertas células (tumorales mismas o inmunitarias), adquieran nuevas capacidades biológicas, por ejemplo la adquisición por las células tumorales de genes codificadores para ciertas citoquinas y que los hacen más inmunógenas.

En el melanoma maligno metastásico se utiliza linfocitos modificados genéticamente in vitro por introducción de genes codificadores con el TNF (factor de necrosis tumoral) el interferón alfa o gamma o el receptor de la interleuquina2, bajo La dependencia de un promotor "fuerte", modificaciones que aumentan la actividad antitumoral de estos linfocitos49-51.

Como se puede concluir por lo leído, las aplicaciones terapéuticas son importantes y numerosas, pero en la actualidad tiene riesgos también importantes como son la infección por transfección de vectores virales , el riesgo de carcinogénesis en un tejido genéticamente alterado la reacción de inmunohipersensibilidad del huésped a células genéticamente manipuladas 52-54

Esto hace exigente cuidadosos estudios en el presente para poder evitar los riesgos y posibilitar la amplia aplicación de la terapéutica genética. Lo que se ha observado en Los tratamientos iniciales en humanos es que parecen ser mucho más seguros de lo que inicialmente se supuso, Lo cual hace prometedor este avance de la biología molecular en un futuro cercano.

---

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Amagai M, Klaus-Kovtum V Stanley Jr Autoantibodies against a novel epithelial cadherine in pemphigus vulgaris, a disease of cell adhesive. Cell 1991; 67: 869-70.

2. Sawamura D, Li K, Vitto J. 230 Rd and 1800 kd bullous pemphigoid antigens are distinct gene products. J Invest Dermatol 1992: 98: 942-3.

3. Bonifas JM, Rothman AL, Epstein EH. Epidermolysis bullosa simplex: evidence in two families for keratin gene abnormalities. Science 199 1; 254:1202-5.

4. Cheng J, Syder AJ, Yu OC, Letal A, Paller AS, Fuchs E. The genetic basic of epidermolytic hyperkeratosis: a disorden of differentiation-specific epidermal keratin genes. Cell 1992, 70: 811-9.

5. Epstein EH. Molecular genetics of epidermolysis bullosa. Science 1992; 256:799-804.

6.Lane EB, Rugg EL, Navsada H, et al. A mutation in the conserved helix termination pelptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature 1 992; 356: 244-6.

7. Vitto J, Chung Honet L, Chistiano AM. Molecular biology and pathology of

type VII collagen. Exp Dermatol 1992; 1: 2-11.

8. Mordosvstev VM, Starkov IV Zabarovski ER, Kisellev LL. Expression of the protooncogenes in psonatic lesions. Arch Dermatol Res 1988; 280: 259-63.

9.Basset-Seguin N, Escat C, Moles JP Blanchard JM, Kerai C, Guilhou JJ. C-fos and c-jun protooncogene expression is discreased in psoriasis: an in situ quantitative analysis J Invest Dermatol 199 1; 97: 672-8.

10. Elder JT, Fisher GL, Lindquist PB, et al. Overexpression of transforming growth factor alpha in psonatic epidermis. Science 19891 243: 8 11-4.

11. Ananthaswamy HN, Price JF Golberg LH, Bales ES. Detection and identification of activated oncogenes in humans skin cancers occurring on sun exposed body sites. Cancer Res 1988;48: 3341-6.

12. Ogiso Y Oikawa T Kondo N, Kusumaki N, Sugihara T Ohura T Expression of protooncogenes in normal and tumors tissues of human skin. J Invest Dermatol 1988; 90: 841-4.

13. Van der Schroeff J, Evers LM, Boot AJ, Bos JL. Ras oncogene mutations in basal cell carcinomas and squamous cell carcinomas of human skin. J Invest Dermatol 1990; 94: 423-5.

14. Greenhaig DA, Yuspa SH. Malignant conversion of munne squamous papilloma cell lines by transfection with the fos oncogene. Mol Carcinog 1988: 1: 134-43.

15. Moles JP Moyret C, Guillot B, et al. p53 mutations in human epithelial skin cancers. Oncogene 1993; 8: 583-8.

16. Das Gupta P Linnenbach AJ, Giaccia AJ, Stamato TD, Reddy EP Molecular cloning of the breakpoint region on chromosome 6, in cutaneous malignant melanoma: evidence for deletion in the c-myb and translocation of a segment of chromosome 18. Oncogene 1989; 4: 120-5.

17. Halaban R, Lagdon R, Birckall N, et al. Basic fibroblast growth factor human keratinocytes in a natural mitogen for melanocytes. J Cell Biol 1988: 107: 161-6.

18. De Robertis EMF Biología celular y molecular. 12a Edison. El Ateneo 1998.

19. Andersen LB, Fountain JW Gutmann DH, et al. Mutations in the neurofibromatosis1 gene in sporadic malignant melanoma. J Invest DermatoJ 1993; 100: 517-9.

20. Goldgar DE, Green P Parry DM, Mulvihill JJ. Muldpoint linkage analysis in neurofibromatosis type1: an international collaboration. Am Hum Genet 1989; 44:6-12.

21. Zucker-Franklin D, Coutavas EE, Rush MG, Zoubias DC. Detection of human T-lymphotropic virus-like particles in cultures of peripheral blood lymphocytes from patients with mycosis fungoicies. Proc Natl Acad Sci (USA) 199 1; 88: 7630-4.

22. Volkenandt M, Soyer HP Cerroni L Koch OM, Atzpodiem J, Kerl H. Molecular detection of clone-specific DNA in hypopigmented lesions in a patient with early evolving mycosis fungoides. Br J Dermatol 1993; 128: 423-8.

23. Fandon FA, Del-Mastro RG, Evans DG, Kilpatrick MW Location of the Gorlin syndrome. Lancet 1992, 1: 581-2.

24. Goudie DR, Yuille MA, Leversha MA. Multiple self-healing squamous epitheliomata (ESS 1) mapped to chromosome 9 q22-q3l in families with common ancestry. Nature Genet 1993; 3: 165-9.

25. Spritz RA Holmes SA Ramesar R, Greenberg J. Curtis D, Beighton P Mutations of the kit (Mast Stem cell growth factor receptor) proto-oncogene accountfora continuous range of phenotypes in human piebaldism. AmJ Hum 1992; 51: 1058-65.

26. Tassabehji M, Read AP Newton VE. Mutations in the Pax-3 gene causing Waardenburg syndrome type 1 and type 2. Nature Genet 1993; 3: 26-30.

27. Tripatirk RK, Strunk KM, Giebel LB, Weleber RG, Spritz RA. Tyrosinase gene mutations in type I (tyrosinase-deficient) oculocutaneous; albinism define two clusters of missence mutations. Am J Med Gen 1992: 43: 865-7 1.

28. White RA Peters LL, Adkison LR, Korsgren C, Cohen CM, Lux SE. The murine pallid mutations is a platelet storage pool associated with the protein 4,2 (pallidim) gene. Nature Genet 1992; 2:80-3.

29. Brilliant MH. The mouse pink-eyed dilution locus: a model for aspects of Prader Willi syndrome, Angelman Syndrome ad a form of hipomelanosis of Ito. Mamm Genoma 1992; 3: 187-91.

30. Schwindinger W Francomano C, Levine M. Identification of a mutations in the gene encoding the a submit of the stimulatory G protein of adenyl cyclase in McCune-Albight syndrome. Proc Nat Acad So USA 1992, 89: 5152-6.

31. Cawthon RM, Weiss R, Xu G, et al. A major segment of the neurofibromatosis type I gene: cDNA sequence, genomic structure, and point mutations. Cell 1990; 62: 103-20 1.

32. Rouleau GA. Alteration in a new gene encoding a putative membrane organizing protein causes neurofilbromatosis type 2. Nature 1993; 353: 5 15-21.

33. Sandford AJ, Shinkawa T, Moffat ME Localization of atopy and subunit of high affinity IgE receptor (FceRI) on chromosome 11 q. Lancet 1993; 34 1: 332-4.

34. Petrovich M, Brand N, Krust A Chambon P A human retinoid acid receptor which belongs to the family of nuclear receptors. Nature 1987: 330: 444-50.

35. Singh DK, Lippman SM. Head and neck cancer: The chemopreventive role of retinoids. Retinoids 1997; 13(l): 2-5.

36. Raffo P Toma S. Role of retinoid acid receptor b expression in head and neck and lung cancer. Retinoids 1998: 1414): 13 1-2,

37. Leid M, Kasner P Chambon P Multiplicity generates diversity in the retinoid acid signalling pathways. TiBS 1992; 427: 433.

38. Mangelsdorf DJ, Ong ES, Dyck JA, Evans RM. Nuclear receptor that identifies a novel retinoic acid response pathway. Nature 19901 345: 224-9.

39. Rees JL, Refern CP Expression of the alpha and beta retinoic acid receptor in the skin. J Invest Dermatol 1989; 93: 81 B-20.

40. Feldman D, Chen T, Hirst M, Closton K, Karasek M, Cone C. Demonstration of 1, 25- hydroxy-vitamin D3 receptors in human skin biopsies. J Clin Endocrinol Metab 1980; 5 1: 1463-5.

41. Gniadecki RV Vitamin D. A modulator of cell proliferation. Retinods 1997, 13(21): 55-9.

42. Scharf SJ, Firedmann A, Steinman L. Specific HLA-DOB and HLA-DRB 1 alleles confer susceptibility to pemphigus vulgaris. Proc Nat Acad Sci USA 1992; 89: 5152-6.

43. Ozawa A, Ohkido M, Inoko H, Ando A, Tsuji K. Specific restriction fragment length polymorphism of the HLA-C region and susceptibility to psoriasis vulgar J Invest Dermatol 1988; 9: 402-5.

44. Christophers E, Henseler T Patients subgroups and inflammatory pattern in psoriasis. Acta Der Venereol 1989, (Suppl 81): 88-92

45. Kantoff PW et al. Correction of adenosine adeanosine deficiency in cultured human T and B cells by retro-virus-mediated gen transfer. Proc Nat Acad So USA 1986: 83: 6563-9.

46. Gerrard AJ, Hudson DL, Brownlee GG, et al. Towards gene therapy for hemophilia B using primary human keratinocytes. Nat Genet 1990: 3: 180-3.

47. Dwarki VJ, et al. Genetherapy for hemophilia A. Production of therapeutic levels of human factor VII in vivo in mice Proc Nat Acad So USA 1995; 92: 1023-7.

48. Hoeben RC, et al. Toward gene therapy for hemophilia A: Long term persistence of factor Vill secreting fibroblasts after transplantation in to immunodeficient mice. Hum Gene Ther 1993, 4: 179:8 1.

49. Mittelman A, Chen. ZJ, Kageshita T, et al. Active specific inmunotherapy patients with melanoma: A clinical trial with mouse andidiotypic monoclonal antibodies elicited with synergic anti-high-molecular weight melanomas associated antigen monoclonal antibodies. J Cl Invest 1990; 86: 36-44.

50. Rosenberg SA, Aebersold P Cornetta K, Gene transfer into humans: Immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. N Engl Med 1990; 323: 570-8.

51. Khavasi AP Krueger GG. Cutaneous gene therapy. Dermatology Clinics 1997; 15/(1): 27-35.

52. Knowles MR, et al. A controlled study of adenoviral-vector-mediated gene transfer in the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis. N Engl J Med 1995: 333: 823-5.

53. Leiden JM. Gene therapy-Promise, pit falls, and prognosis. N Eng. J Med 1995; 333: 87 1-74,

54. Marshall EM. Gene therapy’s growing pains. Science 1995; 269: 1050-5.