Mejoría de la cicatrización de heridas escisionales en piel denervada por sustancia P

MILUSKA Gonzalez-Muller, CARLOS Calderon-Gamarra

RESUMEN

Evaluamos la aplicación subcutánea de la sustancia P (SP) en la cicatrización de heridas de piel denervada por transección del nervio ciático, a través de la velocidad de contracción y el infiltrado inflamatorio en ratas albinas. Realizamos un estudio experimental aleatorizado en tres grupos independientes con heridas escisionales de 5 mm de diámetro en la pata trasera derecha: el grupo I, que no se aplicó tratamiento; el grupo II, con transección del nervio ciático que se aplicó diluyente; y el grupo III, similar al anterior pero que aplicó diluyente más SP. La velocidad de contracción de la herida al cuarto día en los grupos I y III fueron comparables, la del grupo II fue menor respecto a los grupos I y III. El infiltrado inflamatorio al cuarto día fue mayor en el grupo III que en el II. Así la aplicación subcutánea de la SP aumenta la velocidad de contracción y el infiltrado inflamatorio de una herida en piel denervada al cuarto día de injuria.
Palabras clave: sustancia P, cicatrización de heridas, inflamación.

SUMMARY

We evaluated the subcutaneous administration of SP in wounds of denervated white rat skin by sciatic nerve transection. For that we valued the rate of wound contraction and inflammatory infiltrated. We realized randomized experimental study with independent groups with 5 mm diameter excisional wounds in the right hind paw: We did not administer treatment in the group I; we administered dissolvent in the group II (with sciatic nerve transection) and we administered dissolvent plus SP in the group III (with sciatic nerve transection). The rate of wound contraction both group I and group II were similar on the day 4. On this day the rate of wound contraction of the group II was delayed compared with group I and III. The inflammatory infiltrate in the group II was lower than in the group III on the day 4. Therefore, the subcutaneous administration of SP increases both rate of wound contraction and wound inflammatory infiltrate in denervated skin on the day 4 post injure.
Key words: substance P, wound healing, inflammation.

DERMATOLOGÍA PERUANA 2000; 10(2): 97-103

Introducción

Existe una relación entre la inervación cutánea y la respuesta inflamatoria1,2, de tal manera que pacientes con neuropatías periféricas como la secundaria a diabetes, lepra lepromatosa y tabes dorsal presentan un retraso en la cicatrización2-4; mientras se observa una inervación cutánea excesiva en pacientes con cicatrices hipertróficas o psoriasis2,3,5.

La inervación cutánea está dada por los corpúsculos receptores y las terminaciones nerviosas libres6. Existen distintos tipos de terminaciones nerviosas libres, derivadas del ganglio de la raíz dorsal de la médula espinal7: las fibras C y algunas Ad, las cuales llevan señales nociceptivas, derivan de las neuronas pequeñas (oscuras); mientras las fibras Aa /b y algunas Ad, las cuales llevan las señales mecanoceptivas, derivan de las neuronas grandes (claras) del ganglio7. Al producirse una injuria cutánea las terminaciones nerviosas libres de la piel responden, liberando neuromoduladores de la respuesta inmunitaria2-5,7,8, entre ellos la SP que se encuentra principalmente en las fibras C7. Estas últimas están relacionados con la velocidad de contracción6 y el trofismo cutáneo3,5,9. Así una zona de piel denervada tiene una velocidad de cicatrización menor que una normalmente inervada4,10 y una epidermis más delgada11; sin embargo, se requiere por lo menos 30% de fibras para no alterar la cicatrización4.

La SP, neuropéptido perteneciente a la familia de las taquikininas, actúa en los macrófagos produciendo su activación vía receptores NK1 (receptor de más alta afinidad de la SP) en la membrana celular 1 y quimiotaxis4,7. Sobre los mastocitos produce: degranulación y liberación de histamina12, reclutamiento leucocitario por pro

ducción de superóxido12, sean mediados por receptores NK11,12, o por liberación de IL-1 de mastocitos activados1,12. La SP además modula la citotoxicidad de las células asesinas NK activadas por linfoquina12. Regula la producción de citoquinas inflamatorias y factores de crecimiento hematopoyético12. Interviene en las funciones de proliferación, tráfico y acción de linfocitos T y B, vía el receptor NK112.

La respuesta inflamatoria neurogénica está reducida en pacientes con defectos en la inervación cutánea11. Las fibras nerviosas cutáneas que producen la inflamación neurogénica son las fibras aferentes polimodales nociceptoras C14 que derivan junto con las fibras Ad de las neuronas pequeñas (oscuras) del ganglio de la raíz dorsal de la médula espinal; y llevan señales nociceptivas7. Las neuronas que producen la SP son predominantemente fibras C y en pequeña proporción las fibras A, más probablemente las fibras Ad7.

La cicatrización de herida es un proceso complejo en cuya fase inicial se produce el coágulo15. Es la degranulación de plaquetas la que provee las señales quimiotácticas iniciales para la infiltración de células inflamatorias12. La primera línea de células que migran está constituida por los neutrófilos el día 1. La migración de macrófagos se da el segundo día. Y la migración de linfocitos se da durante todo el proceso de cicatrización pero se convierte en la mayor población después del día 1416.

La neuropatía periférica produce una reducción de la inervación cutánea, que a su vez, altera la cicatrización de heridas cutáneas11. Se reconoce ahora que esto es debido a una alteración de la respuesta inmunitaria neurogénica por disminución de la cantidad de fibras nerviosas que liberan neuropéptidos como la SP y el péptido relacionado al gen de la calcitonina (CGRP)7. De la revisión efectuada no se ha encontrado que efecto tendría la aplicación tópica de SP en la velocidad de contracción y el infiltrado inflamatorio; en heridas escisionales experimentalmente producidas sobre piel denervada por transección del nervio ciático.

Por ello el objetivo del estudio fue comparar tanto la velocidad de contracción, como el infiltrado inflamatorio de heridas escisionales cutáneas experimentalmente producidas en ratas macho albinas, luego de producirles transección del nervio ciático y aplicarlas SP intradérmica; para después compararlas con un grupo con transección que recibió diluyente, y un grupo sin transección que no recibió ningún tratamiento.

Material y métodos

Animales

Se utilizó veintiún ratas macho de aproximadamente un mes con un peso entre 100 a 200 gramos, adquiridas en el Instituto Nacional de Salud (Ministerio de Salud, Chorrillos, Lima). Se les proporcionó alimento adquirido en el mismo instituto y agua ad libitum. Se las agrupó aleatoriamente en tres grupos de estudio; en función al tratamiento que recibieron:

• Grupo I: Siete ratas macho sin transección del nervio ciático con dos heridas escisionales en la piel suprayacente a los gemelos de la pata trasera derecha.

• Grupo II: Siete ratas macho con transección del nervio ciático que recibieron 100 µL de solución Tyrode intradérmica en las dos heridas escisionales en la piel suprayacente a los gemelos de la pata trasera derecha.

• Grupo III: Siete ratas macho con transección del nervio ciático que recibieron 100 µL de SP(10-3 M) intradérmica diluida en solución Tyrode en las dos heridas escisionales.

La solución de Tyrode como diluyente del acetato de sustancia P (Sigma®, St Louis, MO, EE.UU.) se preparó como lo describieron Pinter y col.13. El acetato de sustancia P se llevó a una concentración de 1 nmol/100 µL (10-3M).

Transección del nervio ciático

Se anestesió a las ratas con una dilución de 100 mg/mL de tiopental sódico13,17 (dilución de pentotal sódico 1 g), a una dosis de 70 mg/kg vía intraperitoneal. Luego se procedió a realizar una incisión longitudinal de ± 2 cm en la pata trasera derecha, de tal manera que se apreció la bifurcación de los músculos bíceps femoral y semitendinoso5,18. Se realizó una disección hasta identificar el nervio ciático y se procedió a la transección de 3 a 5 mm del nervio5,7,11 y cierre de piel con seda 6/0.

Producción de heridas escisionales y tratamiento

Se anestesió a las ratas con éter en una campana de cristal. Posteriormente se rasuró del pelo de la pata trasera derecha, para luego producir dos heridas escisionales, a nivel de la piel suprayacente a los gemelos, de 5 mm de diámetro con un punch cutáneo. Cada herida estuvo separada por piel sana en por lo menos 1,5 cm. Inmediatamente después de producidas las heridas escisionales se procedió en el grupo II a aplicar 100 µL de solución de Tyrode subcutánea en la piel circundante a la lesión. Se realizó lo mismo con el grupo III, a excepción que se aplicó 100 µL de la dilución de SP de 1 nmol/100 µL (10-3M).

Toma y procesamiento de muestras de heridas escisionales

La toma de muestras se realizó bajo anestesia con éter. Se extrajo la piel circundante a la herida excisional, con esta incluida tanto al segundo y cuarto día de producidas las heridas escisionales. Y se las fijó por 24 horas en formaldehído al 20% para luego ser deshidratadas en alcohol a concentraciones crecientes para luego ser incluidas en parafina.

Se realizó los cortes y posteriormente se procedió al desparafinado y tinción con hematoxilina y eosina.

Velocidad de contracción de la herida

Se midió el diámetro inicial en milímetros, al momento de producirse la herida excisional (día 0); al segundo día y al cuarto día postescisional antes de tomar las muestras. Así al segundo día se tuvieron el doble de observaciones que al cuarto día.

Se determinó la velocidad de contracción de la herida dividiendo la variación de diámetro al segundo y cuarto día entre los días transcurridos, es decir dos y cuatro, respectivamente. El valor se expresó en milímetros por día (mm/día).

Infiltrado inflamatorio

Se tomó una lámina con tinción de hematoxilina y eosina por unidad de estudio y por día postescisional (segundo y cuarto). De cada lámina se examinaron de dos a cuatro campos escogidos al azar, a una magnificación de 200x. En cada campo se realizó el recuento de células inflamatorias, las que estaban constituidas por células mononucleares (linfocitos, células plasmáticas y macrófagos) y polimorfonucleares.

Se tomó la media de células inflamatorias por campo examinado para cada lámina y se asignó dicho valor como infiltrado inflamatorio por unidad de estudio y día postescisional. Se expresó en células inflamatorias por campo de 200x (c.inf/campo x 200).

Análisis estadístico

La velocidad de contracción de la herida (mm/día) y el infiltrado inflamatorio (c.inf/campo x 200), son expresados en media ± error estándar para cada grupo y día postescisional.

Para detectar diferencia estadísticamente significativa se realizó un Anova de un sentido (nivel de significación p < 0,05) y una prueba LSD postAnova (95% intervalo de confianza).

Resultados

Animales

De las 21 ratas, luego de la transección del nervio ciático, dos fallecieron por complicaciones de la anestesia: una del grupo II y otra del grupo III. Las demás toleraron el acto quirúrgico y el postoperatorio. A las tres semanas de la transección del nervio ciático se procedió a producir las heridas escisionales y fallecieron dos ratas del grupo III por complicaciones de la anestesia. Quedaron, así, siete ratas en el grupo I, seis ratas en el grupo II y cuatro ratas en el grupo III para el segundo día postescisional. Luego de la toma de la muestra de la herida al segundo día, una rata del grupo II falleció por complicaciones de la anestesia. Finalmente para el cuarto día postescisional hubo siete ratas en el grupo I; cinco, para el grupo II; y cuatro para el grupo III.

Velocidad de contracción de la herida

Segundo día

Al comparar los tres grupos experimentales se encontró que el grupo que no recibe tratamiento (grupo I), tiene una velocidad de contracción de la herida (1,411 ± 0,056 mm/día) significativamente mayor que el grupo con transección del nervio ciático que recibe diluyente (grupo II (0,708 ± 0,097 mm/día) y el que recibe SP (grupo III) (0,95 ± 0,138 mm/día). Si bien el grupo III tiene una velocidad de contracción mayor que el grupo II, esta diferencia no es estadísticamente significativa.

Cuarto día

Al cuarto día la velocidad de contracción de la herida del grupo I (0,929 ± 0,046 mm/día) es significativamente mayor, que la del grupo II (0,725 ± 0,025 m/día). No hay diferencia en las velocidades del grupo I y III (0,929 ± 0,046 mm/día versus 0,894 ± 0,054 mm/día). Y hay diferencia estadísticamente significativa entre el grupo III y el grupo II (0,894 ± 0,054 mm/día versus 0,725 ± 0,025 mm/día) (ver Tabla I)

Infiltrado inflamatorio

Segundo día

Al segundo día se aprecia en los grupos I y II infiltrado inflamatorio a predominio de linfocitos, macrófagos y células plasmáticas, siendo menor los polimorfonucleares a nivel de la dermis perilesional. Sin embargo en el grupo III el infiltrado inflamatorio fue a predominio de polimorfonucleares.

Si bien el segundo día el infiltrado inflamatorio es mayor en el grupo III (299,325 ± 53,321 c.inf/campo x 200) respecto al grupo I (165,667 ± 36,252 c.inf./campo x 200) y II (166,667 ± 37,897 c.inf./campo x 200) no se encontró diferencia estadísticamente significativa entre las medias (p = 0,087). No se tomó en cuenta un individuo del grupo I por falla al procesar la lámina histológica.

 

Cuarto día

La cantidad de macrófagos en el grupo I fue mayor que en el grupo II, y comparable al grupo III (datos no mostrados). Al cuarto día igual que al segundo día se aprecia mayor cantidad de polimorfonucleares en el grupo III que en los grupos I y II; pero menos que al segundo día en el mismo grupo.

El infiltrado inflamatorio en los grupos I y II fue a predominio de linfocitos, macrófagos y células plasmáticas. El grupo III presentó el mayor infiltrado (306,75 ± 9 c.inflamatorio/campo 200x), que si bien no tuvo diferencia significativa, respecto al grupo I (210,893 ± 27,261 c.inflamatorio/campo 200x); si la tuvo respecto al grupo II (160,766 ± 8,57 c.inflamatorio/campo 200x).

No se encontró diferencias entre el grupo I y el grupo II. No se tomó en cuenta dos unidades de estudio en el grupo III por falla técnicas al momento de aplicar la SP (Ver Tabla 2).

Discusión

Luego de producida la transección del nervio ciático en la rata, la denervación cutánea aparece a las 48 horas en la pata trasera de la rata5,11. Esto altera la cicatrización de heridas, ya que son las fibras C las que predominantemente secretan la SP11; neuropéptido que como se mencionó está íntimamente relacionado con el proceso de cicatrización de heridas2,12. Con el fin de evitar el "efecto transneural", descrito por Scott y col., por el cual se observa una respuesta inflamatoria neurogénica reducida en un nervio cuando su homólogo contralateral es lesionado14; utilizamos un grupo independiente como control: grupo I. Por ello este modelo convino para estudiar el efecto de la aplicación exógena de la SP en la cicatrización de heridas.

En este experimento se aprecia que al segundo día postescisional la velocidad de contracción de la herida es mayor en el grupo con inervación normal respecto a los que tienen transección del nervio ciático y en consecuencia denervación. Al observar el infiltrado inflamatorio se aprecia que no hay diferencias estadísticamente significativas entre los grupos; aunque si una no estadística que pudiera deberse al tamaño muestral, entre el grupo denervado que recibe SP y los grupos denervado que recibe diluyente (solución de Tyrode) y con inervación normal. Ello podría deberse a que el diluyente esté actuando estimulando el infiltrado inflamatorio, que hace que éste no sea menor en el grupo II, como se esperaría; sino comparable al grupo I, pero que no altera la velocidad de contracción de la herida que si es menor al grupo I. Con respecto al grupo III si bien no hay diferencia entre éste y el grupo I ni el grupo II, se aprecia un mayor infiltrado con respecto al grupo II, hay aquí un efecto adicional que permite esta diferencia. El tipo celular que predomina son los neutrófilos. Se sabe que la SP estimula la quimiotaxis y activación de neutrófilos3,12,19 aunque está en discusión si es directamente o vía degranulación y liberación de IL-1 de mastocitos actividades1,13,19.

Tomoe y col. encontraron que con la aplicación subcutánea de soluciones de SP 10-7 a 10-5 M y del péptido N-terminal SP 1-9 10-5 a 10-4 M en piel de rata hubo un aumento significativo del infiltrado de granulocitos (neutrófilos y eosinófilos)19; lo cual concuerda con nuestros resultados. Además la SP al actuar sobre las células endoteliales hace que éstas secreten IL-8, principal quimiotáctico de neutrófilos, y expresen la molécula de adhesión vascular-celular 1 (VCAM01)2 que favorece la diapedesis, y explicaría el infiltrado predominantemente neutrofílico observado por nosotros. Al cuarto día la velocidad de contracción de la herida del grupo III se ha hecho comparable a la del grupo I y mayor que la del grupo II; mientras la velocidad de contracción del grupo II permanece menor que la del grupo I. Se deduce que el efecto de la aplicación de la SP en la velocidad de contracción de una herida excisional en piel denervada se observa al cuarto día, ya que se comprueba que una herida excisional en piel denervada que recibe diluyente es significativamente menor que la hecha en piel normalmente inervada. Entonces la SP hace que a pesar de la denervación la velocidad de contracción sea comparable a la de una piel normalmente inervada y mayor a la que sólo recibe solución de Tyrode.

Richards y col, produjeron heridas escisionales de 1 cm de diámetro sobre piel denervada a través de colgajos libres inguinales con sólo reanastomosis vascular y la compararon con heridas similares en piel normalmente inervada en ratas; y encontraron una disminución en la velocidad de contracción de la herida en la piel denervada3,9. Nuestros resultados concuerdan con estos resultados; sin embargo, Wallengren y col, quienes hicieron heridas escisionales en piel denervada luego de transecar el nervio ciático, no encontraron diferencias en la velocidad de contracción de la herida4. No obstante como ellos mismos discuten las heridas fueron de 3 mm, lo cual pudo ocultar las diferencias mínimas4. Por otro lado éstas fueron hechas en la parte lateral del muslo, mientras que nosotros las hicimos en la piel suprayacente a los gemelos.

De la revisión bibliográficas efectuada no encontramos el efecto de la aplicación subcutánea de SP en la velocidad de contracción de una herida excisional cutánea, pero si en la velocidad de cierre de una herida en el epitelio corneal en conejos20. Kingsley y Marfurt produjeron lesiones circulares de 6,5 mm de diámetro en el epitelio corneal de conejos para luego aplicar tópicamente SP a tres concentraciones: 5 x 10-5 M, 5 x 10-4 M y 5 x 10-3 M no encontrando diferencias respecto a un control20. Al analizar el infiltrado inflamatorio existe diferencia entre el grupo con invervación normal y el denervado tratado con solución de Tyrode más SP pero no significativa; y diferencia significativa entre éste último y el grupo denervado tratado con solución de Tyrode. Comparando la cantidad de macrófagos del grupo II respecto al grupo I (datos no mostrados) tienen una relación similar a la encontrada por Richards y col, en la que los macrófagos en una piel denervada fueron menores a los encontrados en una normalmente inervada al cuarto día de producidas las heridas3. Sin embargo para cuantificar los macrófagos se necesitaría inmunohistoquímica como en su estudio. El grupo III mostró una cantidad similar de macrófagos al cuarto día postescisional, que el grupo I. Con esto último se puede inferir que la SP está actuando para provocar estas diferencia. Y ulteriormente que esta diferencia de infiltrado inflamatorio actuarían en la mejoría de la velocidad de contracción al cuarto día.

El recuento de macrófagos tiene un pico al segundo día de producida una herida, y son los que modulan el proceso inflamatorio a través de citoquinas16. Posiblemente la SP actúa sobre ellos al segundo día y modula un aumento de contracción de la herida y un aumento del infiltrado inflamatorio al cuarto día. Estudios previos demuestran que la piel denervada respecto a una normalmente inervada no muestra diferencias de infiltrado al segundo pero si al cuarto día, donde el conteo de macrófagos y linfocitos T es menor3,9. Al producirse una solución de continuidad se forma inicialmente el coágulo de fibrina con plaquetas embebidas que rápidamente dan señales quimiotácticas inflamatorias3,15. La percepción del dolor implica la liberación de SP de las fibras C4, que no sólo se encuentran en la epidermis sino también alrededor de los vasos sanguíneos3. Se produce una señal transmitida del tejido injuriado inervado al sistema nervioso central (ganglio de la raíz dorsal) a través de las terminaciones nerviosas libres (señal ortodrómica) y luego a la inversa (señal antidrómica) que produce la liberación de neuropéptidos1,2. Así por un lado induce la quimiotaxis inflamatoria (inicialmente neutrófilos y luego macrófagos)1-3,13; y por otro lado aumenta la permeabilidad microvascular que conduce al edema neurogénico1,3,8,21; y estimula la proliferación endotelial3, así como la adhesión de células inflamatorias a éste mediante VCAM-12. No obstante, Senapati y col. encontraron una disminución significativa tanto de la SP, CGRP como de la somatostatina dos días después de la injuria y ésta permanecía así por dos semanas22; la cuantificación de la SP en tejido injuriado presenta dificultades técnicas que pueden conducir a resultados engañosos1.

Conocer la forma como interactúa el sistema nervioso con el inmunitario, puede servir de base para la búsqueda de nuevos tratamientos en los cuadros en que ambos están implicados. Por ejemplo, cuando existe una neuropatía secundaria a diabetes, mejorar el curso prolongado delas úlceras2,10. De igual manera, mejorar el tiempo de cicatrización en pacientes con lesiones medulares (por ejemplo parapléjicos)2, aquellos con lepra lepromatosa o tabes dorsal3,4. Y también contrariamente cuando la inervación sea excesiva, como en la psoriasis o las cicatrices hipertróficas2,3,5, tratar de disminuir el estímulo inflamatorio neurogénico.

En conclusión la aplicación intradérmica de la sustancia P en una herida cutánea escisional, aumenta la velocidad de contracción y el infiltrado inflamatorio en piel denervada al cuarto día de producida. Y la velocidad de contracción de una herida cutánea es mayor en una piel normalmente inervada respecto a una denervada tanto al segundo como al cuarto día de producida.