S-4 BIOLOGÍA MOLECULAR EN DERMATOLOGÍA

Moléculas de adhesión, generalidades y mecanismos de acción

Dr. Iván Jara Padilla (Chile)

Las moléculas de adhesión celular (MAC) son familias de proteinas de membrana presentes en múltiples células y tejidos que unen células entre sí y son vía de comunicación entre Células. Todas las MACs poseen una zona extraplasmática, una zona de membrana y una zona intracitoplasmática. La unión de dos MACs de una misma familia es denominada, unión homofílica y entre dos familias diferentes, unión heterofílica.

Las MACs son receptores celulares, que transmiten información hacia o desde las células. Receptores de agentes infecciones: virus VIH, rinovirus. Mantienen integridad de tejidos: piel. Higado, etc. Importantes en los procesos inflamatorios. Básicas en el tráfico celular. Adhieren células entre sí y células a moleculas de matriz. Todas las adhesiones son leves a intensas pero nunca definitivas o irreversibles. Las MACs pueden tener cambios cualitativos, cuantitativos y conformacionales. Existen cascadas de adhesiones dadas por las diferentes MACs.

Son clasificadas en familias: integrinas, inmunoglobulina gen superfamilia, selectinas, caderinas, otras.

Familia de las interinas

Son MACs, formadas por un heterodímero constituido por una cadena alfa unida en forma no covalente a una cadena beta. La porción extracelular funciona como receptor que se une a otras proteinas de la matriz extracelular como: colágeno, fibronectina, laminina y también se une a otras MACs (Ig. superfamilia: ejm. ICAM-1) en forma heterofílica.

Según el tipo de la cadena beta las integrinas se clasifican en subfamilias: Las beta-2 integrinas o integrinas leucocitarias son las más importantes. ya que están presentes en todas las células de estirpe linfoide y mieloide. Son fundamentales en el proceso de adhesión de los PMNs al endotelio. Las integrinas leucocitarias comparten la cadena beta CD18 y van cambiando la cadena alfa, es así que tenemos CD11 a/CD18 que es el LFA-1 expresado en todos los leucocitos y su ligando natural es el ICAM-1 presente en los endotelios. El LFA-1 o CD11a/CD18 ejerce un rol regular importantísimo en la migración y tráfico de leucocitos al sitio de la inflamación. Las integrinas leucocitarias de los PMNs inflamatorios sufren cambios conformacionales en la superficie de estos logrando éstos ser más adhesivos. Además, los PMNs pueden sintetizar mayor cantidad de integrinas leucocitarias logrando ser muy adhesives, esto siempre sucede en los procesos inflamatorios cutáneos y sistámicos.

Familia inmunoglobulina gen superfamilia

Para pertenecer a esta familia de MACs hay que poseer, al menos, un dominio de inmunoglobulina y por eso mismo esta es una gran familia formada por: moleculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) I y II; receptor linfocitario TCR (receptor antigónico de células T); Correceptores CD3, CD4, CD8, CD28, CD86 (B7); LFA-2 y LFA-3: antígeno asociado a función leucocitaria; MACs ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3. Moleculas de adhesión vascular VCAM- 1. Otros: Mad CAM-1, PECAM-1.

Función de las Igs. Superfamilas: presentación y reconocimiento de antigenos; adhesiones celulares.

El ICAM-1: es el representante mas importante, tiene cinco dominios de inmunoglobulina y tiene amplia distribución en: queratinocitos, célula endotelial, célula de Langerhans, fibroblasto, linfocitos. Es también el receptor celular para rinovirus. Se expresa debilmente en células no estimuladas (piel normal). Al primer dominio de Ig se une LFA-I (beta-2 integrina o integrina leucocitaria). Tercer dominio de Ig se une a MAC-1 (beta-2 integrina o integrina leucocitaria).

 

Familia de las caderinas

Esta familia es muy importante en dermatología ya que está presente en la piel, especialmente en los desmosomas, es decir los queratinocitos están unidos entre sí por caderinas. Sus dominios intracelulares interactúan con proteinas y filamentos intermedios.

Células metastásicas: tienen menor número de caderinas en su superficie.

Caderinas en el queratinocito: están presentes en el desmosoma, es decir, la adhesión entre queratinocitos está dada por una unión homofílica entre caderinas. Esta unión es muy fuerte pero no permanente.

Las caderinas desmosomales son dos: 1) desmogleinas (1, 3), la desmogleina-1 está ubicada en la parte alta de la epidermis y la desmogleina-3 especialmente en el estrato espinoso de la piel 2) desmocollinas (I, II), la parte intracitoplasmática de las caderina, desmosomales, se unen, en placa citoplasmática del desmosoma, con placoglobina y desmoplaquina que son el sitio de unión de los filamentos intermedios.

Queratinocitos y células de Langerhans expresan E-caderina; esto viene a explicar su permanencia en epidermis por unión homofilica/no permanente.

Nuevas ténicas en microbiología

Jaime A. Tschen. MD - Houston, Texas E.U.A.

La especialidad de los ácidos nucleicos en lo que respecta a su secuencia y en el tipo de proteinas que estas secuencias determinan, hacen de estas moléculas unos blancos perfectos para determinar si cierto organismo se encuentra o no presente en una muestra por pequeña que sea. Por otra parte la alta sensibilidad de las técnicas puede dar muchos falsos positivos si no se observan estrictas reglas de procesado para evitar contaminaciones mínimas que serán posteriormente detectadas al ser la señal amplificada.

Las dos técnicas que se utilizan, tanto en el uso cotidiano pero más en el investigativo son la hibridación in situ y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Estas ténicas son complementarias en muchos casos y cada una posee características únicas que las hacen útiles en situaciones diferentes. Se ha dicho que la hibridación in situ es como la invención del papel carbón y que la PCR es como la xerocopiadora.
 

La hibridación in situ

En esta técnica se aplican las técnicas básicas de hibridación de los ácidos nucleicos a tejidos o frotes en laminas histológicas. En esta forma se acopla la capacidad de sondear secuencias de ácidos nucleicos con la especificidad de localizarlos micoscópicamente en el tejido. Esta técnica parte de marcar una sonda nucleica, ya sea con material radioactivo o una proteina detectable, por una reacción de peroxidasa-antiperoxidasa; aún más, en ciertos casos se puede detectar, no solo el ácido nucleico, sino también la proteina que ese mismo ácido determina en la misma preparación histológica.

El hecho que los acidos nucleicos se preservan muy bien en tejido procesado en parafina hace posible que material que ha estado por décadas en bloques de parafina pueda estudiarse y encontrar infecciones (especialmente virus o micobacterias) difíciles de cultivar o del todo no cultivables. Hay actualmente, muchas sondas preparadas comercialmente que evitan el laborioso proceso de preparación de las mismas. Hay también laboratorios que le prepararán unas a sus especificaciones. La mayoría de las sondas en uso son de tipo cADN aunque las hay de tipo ARN y oligonucleótidos.

La hibridación in situ es un proceso laborioso y cada paso requiere seguir la técnica estrictamente, para evitar resultados poco aceptables o del todo inútiles. Las sondas radioactivas reducirán una emulsión fotográfica y las sales de plata serán aparentes en la lamina, lo que permite hacer conteos de los granos en una célula infectada, por ejemplo. Las sondas no radioactivas estan acopladas a biotina y se desarrollan mediante avidina-biotina-peroxidasa, como en las reacciones de inmunohistoquímica. El uso de controles y de procesos enzimáticos para aumentar las señales también es importante mencionarlo. Es mediante esta ténica, que infecciones latentes (el virus se ha incorporado al ADN de la célula), en las que particulas virales no se pueden detectar, la hibridación las desenmascara. También la técnica se ha utilizado extensamente en la tipificación del virus del papiloma que es de mucha utilidad cuando se trabaja con lesiones premalignas (papulosis bowenoide).

La reacción en cadena de la polimerasa

Fue apenas en 1985 cuando esta técnica se descubrió y desde entonces sus usos y aplicaciones han crecido considerablemente. Esta ténica permite detectar fragmentos especificos de ácidos nucleicos de agentes infecciosos. La sensibilidad fenomenal de la PCR se ilustra por el hecho de poder detectar un ADN específico con una sola célula. La especificidad está determinada por fragmentos de ADN o oligonucleótidos que solo se acoplan al ADN en cuestión y la amplificación la hará la polimerasa que es termoestable.

Para poder hacer la reacción se necesita una fuente de ácidos nucleicos purificados, la enzima (polimerasa), los buffers y los oligonucleótidos o "primers". Como en todo lo moderno, se ha automatizado mediante un termociclador que pasará por los tres pasos muchas veces. Estos pasos son: a) de naturalización de la doble cadena- b) acoplamiento de los primeros: y. c) extensión de la cadena complementaria usando la polimerasa.

El primer paso se obtiene subiendo la temperatura arriba de 90º C, las cadenas permanecerán separadas hasta que la temperatura baje, al bajar la temperatura se adhieren los primeros que están en exceso, comparados con las cadenas primarias. Los estudios comúnmente incorporan de 20 a 40 ciclos con una amplificación de un millón de copias. El producto se separa por electroforesis y se identifican bandas.

Nuevamente la contaminación es un problema muy importante tanto que se pueden detectar virus en agua tridestilada o en bloques de parafina, sin ningún tejido, solamente el tocar una cuchilla del microtorno sin guantes puede causar contaminación significativa. Otra desventaja es que no localiza el ADN a una estructura específica en el tejido.

Referencias

1. Remik DG. Molecular Pathology 1992: Clinical aplications of molecular biology 165-174.

2. Duvic M. In situ hilbridization, Clinics in Dermatology 1991; 9: 129-135.

3. Jester JD. The polimerase chain reaction. Clinics in Dermatology 1991; 9:137-141.

 

Desórdenes de la queratinización

Amy S. Paller MD

Proteínas de queratina

-40 a 70 proteinas kD
-85% del total de la proteina de la célula del queratinocito
-Dominio del bastoncillo alfa helicoidal 310-aminoácido
-Esencial para estructuras filamentosas intermedias y el rizo
-Queratina del tipo I y del tipo II agrupadas en heterodímeros paralelos
-50 a 9% de homología entre las regiones helicoidales de tipo I
-25 a 35% de homología entre las regiones helicoidales de tipo I y II
-Queratina de tipo I: mayor acidez (pKi 4,5 - 5,5), menor (40 - 56.5 kD); queratina 9,10,14. (11,15, 16, 19 y otros); gen localizado en el cromosoma 17q12-21.
Queratina de tipo II: neutral, básico (pKi 5,5 - 7,5), mayor (52-07 kD): queratina 1, 5, (2, 4. 6, 7, 8, y otros); gen localizado en el cromosoma 12q 11-13.

 

Epidermólisis bulosa simple

•Grupo de desórdenes predominantemente autosómicos que varian en gravedad. Está limitado a las manos y a las plantas de lo pies (Weber-Cockayne), uñas y recubrimiento de las mucosas (tipo Dowling-Meara).

•Formación de ampollas superficiales a través de los queramiocitos basales que no produce cicatrices.

•Evidencia de anormalidades en lo que respecta a la queratina mediante la microscopia electrónica y la microscopia inmunoelectrónica.

•Desarrollo del modelo transgenético del ratón con mutación en la queratina 4.

•Demostración de mutaciones en queratina 5/14 en pacientes con epidermólisis bulosa simple.

-Tipo más grave (tipo Dowling-Meara) que presenta Mutaciones en las regiones más importantes del gene de la queratina, por lo general 125 mutaciones de la queratina 14).

- Epidermólisis simple (tipo Koebner). Mutaciones menos críticas del dominio más próximo a la queratina 14.

- Epidermólis bUlosa simple (tipo Weber-Cockayne). Mutaciones generalmente en la región 1-2 o en la reglon proximal del gen de la queratina 5.

• Disminución de ampollas y aumento de la queratodermis, en especial, en el plasma de las manos y la planta de los pies.

Eritrodermia ictiosiforme congénita bulosa

(Hiperqueratosis epidermolítica)

•Desorden autosómico dominante poco común (1: 3000 000 nacimientos)

•Precencia de ampollas diseminados, de grosor moderado.

• Las escamas son marrones, grasosas y verrucosas.

• Preferencia por las articulaciones y áreas flexionales.

•Eritrodermia variable.

•Generalmente se presenta un ensanchamiento de la palma de las manos y la planta de los pies.

• Aumento de la escamación y disminución de las ampollas a medida que pasa el tiempo.

•Propensión a la piodermia estafilocócica.

•La microscopia inmunoelectrónica muestra célas basales normales y agrupaciones de tonofilamentos de queratina y epidermólisis de queratinocitos suprabasales.

•Las mutaciones con la queratina 10 muestran el fenotipo de la hiperqueratosis epidermolítica.

•Mutaciones encontradas en los pacientes en la queratina 1 y en la queratina 10 para la eritrodermia ictiosiforme congenita que presenta correlación entre la gravedad de la enfermedad y la localización de la mutación dentro del gen de la queratina.

•La ictiosis bulosa de Siemens que presenta una mayor cantidad de empollas superficiales es el resultado de las mutaciones de queratina 2e.

 

Queratodermis palmar


-Desorden autosómico dominante que compromete las uñas

-Forma Jadassohn-Lewandowsky (cambio en las uñas. queratodermis palmoplantar, leucoqueratosis).

-Tipo Jackson-Lawler (cambio en las uñas, queratodermis palmoplantar, quistes).

-Mutaciones encontradas para el tipo I en las queratinas 6a y 16: mutaciones encontradas para el tipo II en las queratinas 6b y 17: expresividad variable dentro de las familias.

-Correlación entre el fenotipo clínico y el gen afectado.

 

Moniletrixia

- Desorden autosómico dominante asociado a una prominencia folicular del cabello.

-Mutaciones en la queratina de cabello tipo II: hHbl y hHb6

Nevo epidérmico, tipo hiperqueratósico epidermolítico

• Localización conocida de la hiperqueratosis epidermolítica en los genes de la queratina 1 y 10.

• Casos de familias con nevo, epidérmico parenteral de tipo EH y su descendencia con un EH generalizado.

• El nevo, epidérmico de tipo EH es una forma mosaica de hiperqueratosis epidermolítica generalizada.

• Puede no detectarse mutaciones en los linfocitos o fibroblastos.

• La descendencia con EH garantiza un mosaicismo gonadal.

• La presencia de un mosaicismo gonadal y somático sugiere una mutación temprana.

• Las manifestaciones cutáneas más extensas sugieren también una mutación temprana y pueden guardar correlación con el aumento de riesgo en el caso de la descendencia.

 

Diagnóstico prenatal con técnicas moleculares

• Permite la detección mediante el análisis de ADN obtenido por muestras de vello coriónico o amniocentesis.

• Realizado para la hiperqueratosis epidermolítica.

• Particularmente importante para el diagnóstico prenatal de la epidermólisis bulosa y de epidermólisis bulosa distrófica recesiva.

Posibilidad de un diagnóstico de preimplantación

• Luego de la fertilización in vitro, son extraidas una o más células del embrión para el análisis genético.

• La extracción de una célula de un embrión que tiene ocho células no trae efectos adversos.

• Los embriones no afectados son identificados y transferidos al útero a través de ténicas de fertilización in vitro.

• Se puede evitar los resultados del primer y segundo trimestre.

 

Terapia genética

-El reemplazo del gen estructural requiere su introducción a cada célula.

-Transfección in vitro con expansión y trasplante contra introducción in vitro.

c. Desórdenes recesivos pueden ser corregidos con mayor facilidad.

d. Las mutaciones del gen de la queratina son, por lo general, todas mutaciones dominantes negativas y, por lo tanto, requieren de la extracción o inactivación del gen de cada célula para efectuar la corrección.

e. Problemas: Ineficiencia de la transferencia del gen; expresión duradera del gen; introducción a células que dan origen a un tipo específico de células.

 

Referencias Bibliográficas

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3. Letai A, Coulombe PA, McCormick MB, et al. Gravedad de la enfermedad en correlación con la posición de las mutaciones de queratina en los pacientes con epidermólisis bulosa simple. Proc Nall Acad Sci EE.UU. 1 993; 90: 3197-201.

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